Έκφραση γονιδίων των υπομονάδων του ανθρώπινου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και κατασκευή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των υπομονάδων αυτών

Abstract

The aim of the present study was the expression and subsequent refolding of recombinant polypeptides, which correspond to the human nicotinic acetylcholine receptor (AChR) subunits, as well as the isolation of monoclonal antibodies (mAbs) against these subunits. Polypeptide fragments from the a1, a3 and a4 AChR subunits were expressed in the heterologous expression system of E. coli. The α1(1-207) polypeptide was then refolded in vitro following the “artificial chaperone” method. When tested in enzyme-linked - (ELISA) or radio- (RIA) immunoassays, the refolded α1(1-207) polypeptide showed significant binding of monoclonal antibodies diverted against partly or totally conformation-dependent epitopes on the main immunogenic region (MIR)of AChR. Refolded polypeptides which contain epitopes of pathogenic antibodies against the muscle AChR can be potentially used both in structural studies, for analysis of the antigenic AChR structure, and in developing novel therapeutic approaches for myasthenia gravis. Regarding the anti-AChR antibody production, a mAb against the α4 AChR subunit was isolated using the α4(1-214) polypeptide and the hybridoma technology, and further characterized. This mAb can be applied to study neuronal AChRs, as well as the diseases where these receptors are implicated.

Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο την έκφραση και την αναδιάταξη ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων, που αντιστοιχούν σε εξωκυτταρικά τμήματα των υπομονάδων του ανθρώπινου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, καθώς και την κατασκευή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των υπομονάδων αυτών. Με τη χρήση του ετερόλογου συστήματος έκφρασης της E. coli πραγματοποιήθηκε η έκφραση πολυπεπτιδικών τμημάτων από τις α1, α3 και α4 υπομονάδες του υποδοχέα. Ακολούθησε η αναδιάταξη in vitro του πολυπεπτιδίου α1(1-207) με τη μέθοδο των τεχνητών συνοδών μορίων. Με τη χρήση ανοσοενζυμικών (ELISA) και ραδιοανοσολογικών (RIA) μεθόδων το αναδιαταγμένο πολυπεπτίδιο α1(1-207) εμφάνισε μεγάλη ικανότητα να προσδένει μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κύριας ανοσογόνου περιοχής (MIR) του υποδοχέα, οι επίτοποι των οποίων εξαρτώνται πλήρως ή μερικώς από τη φυσική διαμόρφωση του υποδοχέα. Τέτοια αναδιαταγμένα πολυπεπτίδια, που διαθέτουν επίτοπους παθογόνων αντισωμάτων κατά του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, μπορούν να έχουν εφαρμογή τόσο σε δομικές μελέτες για την ανάλυση της αντιγονικής δομής του υποδοχέα, όσο και στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη βαριά μυασθένεια. Παράλληλα, στην παρούσα διατριβή με τη χρήση του πολυπεπτιδίου α4(1-214) και τη βοήθεια της τεχνικής υβριδώματος παρασκευάστηκε και μελετήθηκε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της α4 υπομονάδας του υποδοχέα, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μελέτη των νευρικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης και των ασθενειών του ανθρώπινου οργανισμού, στις οποίες αυτοί εμπλέκονται.