Αντιμετώπιση των ριζόκομβων νηματωδών (Meloidogyne incognita) σε θερμοκηπιακές καλλιέργειες με φυσικά προϊόντα και μελέτη της χημικής σύστασης αυτών

Abstract

Ten botanical species have been studied for their nematicidal activity against the root-knot nematode M. incognita. The chemical composition of the extracts used, for the nematodes control, was determined as well. Lamiaceae: the essential oils of eight greek aromatic plants were extracted and studied, namely: Melissa officinalis, Sideritis clandestina, Origanum dictamnus, Ocimum basilicum, Mentha pulegium, Origanum vulgare, Vitex agnus castus and Salvia officinalis. Strongly nematicidal were found: Origanum vulgare, Origanum dictamnus, Mentha pulegium and Melissa officinalis. The EC₅₀/₉₆h values were calculated at 1.5, 1.7, 3.1 and 6.1 μl ml⁻¹ respectively. The strong activity was attributed to the high contents of carvacrol according to GC-MS analysis. Carvacrol together with two other monoterpenes, namely carvon and geraniol, provoked 100% paralysis when tested alone at concentrations of 0.5 μl ml⁻¹. On the contrary 1,8 cineol and limonene tested alone did not exhibit high nematicidal activity. Meliaceae: two species were studied namely: Azadirachta indica & Melia azedarach. The formulated nematicide AzaNema® 1 % EC as well as the technical grade azadirachtin 11.8 % (commercial extract of A. indica) were used. The registered formulated product’s dose 6 1 ha⁻¹ was initially expressed as 0.2 μg a.i ml⁻¹ and 0.03 μg a.i g according to Weber et al., 2000, for the microwell and pots experiments performance, in water and soil respectively. Fosthiazate was used as control, at its registered dose as well. Both azadirachtin products were not nematicidal at the registered dose, even though azadirachtin residues in the test solutions remained stable throughout biological experiments according to HPLC analysis. Grind lyophilized fruits of the species Melia azedarach as well as a polar (methanol) and non polar (hexane) extract were tested against M. incognita. The EC50 value for methanol extract in microwells was calculated at 0.04 % (w/v) and in pots at 0.9 % (w/w). Additionally, the EC₅₀ value for the grind lyophilized fruits in pots was calculated at 0.4 % (w/w). In the search for active ingredients in the melia methanol extract, chromatographic techniques were established for its limonoids separation (TLC and Column Chromatography) and purity control (HPLC). Their identification was performed with ¹H and ¹³C NMR analysis. The mass error was calculated with a LC/MS Q-TOF analysis. The mass spectra of the limonoids were also identified, using LC/MS analysis.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η νηματωδοκτόνος δράση 10 βοτανικών ειδών εναντίον του κομβονηματώδη M. incognita και προσδιορίστηκε η χημική σύσταση των εκχυλισμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην καταπολέμηση. Τα βιολογικά πειράματα αφορούσαν στην πρόκληση παράλυσης σε προνύμφες δευτέρου σταδίου ανάπτυξης (J2) του M. incognita, που είναι το μολυσματικό στάδιο του βιολογικού του κύκλου, καθώς και στην επίδραση στον βιολογικό κύκλο εντός της ρίζας προσβεβλημένων φυτών τομάτας. Οι βοτανικές οικογένειες που μελετήθηκαν ήταν η Lamiaceae και η Meliaceae που περιέχουν βιολογικά ενεργά συστατικά, τα τερπενοειδή (μονο- και σεσκιτερπενοειδή) και τα λιμονοειδή (τετρανορτριτερπενοειδή) αντίστοιχα. Σε ότι αφορά τα Lamiaceae, μελετήθηκαν για την ικανότητα παράλυσης σε J2 τα αιθέρια έλαια, και κάποια συστατικά τους τερπένια, που απομονώθηκαν από τα εξής οκτώ ελληνικά αρωματικά φυτά: Melissa officinalis, Sideritis clandestina, Origanum dictamnus, Ocimum basilicum, Mentha pulegium, Origanum vulgare, Vitex agnus castus και Salvia officinalis. Πλέον δραστικά βρέθηκαν τα αιθέρια έλαια των ειδών O. dictamnus, O. vulgare, M. pulegium και M. officinalis για τα οποία υπολογίστηκαν οι τιμές EC₅₀. Η υψηλή αποτελεσματικότητα των αιθέριων ελαίων του O. vulgare και O. dictamnus, αποδόθηκε στην υψηλή τους περιεκτικότητα σε καρβακρόλη ενώ αντίστοιχα ισχυρά νηματωδοκτόνα μεμονωμένα συστατικά τερπένια αποδείχθηκαν η καρβόνη και η γερανιόλη. Αντίθετα το λιμονένιο και η 1,8-κινεόλη παρουσίασαν χαμηλή αποτελεσματικότητα. Από τα Meliaceae μελετήθηκαν δύο είδη και συγκεκριμένα το Azadirachta indica & το Melia azedarach. Μελετήθηκε η δραστική ουσία αζαδιραχτίνη, που περιέχεται στο είδος Azadirachta indica, με τη μορφή τόσο του τεχνικώς καθαρού προϊόντος όσο και του σκευάσματος AzaNema® 1 % EC, εγκεκριμένου ως νηματωδοκτόνο, στη συνιστώμενη δόση του για καταπολέμηση των κομβονηματωδών, σε πειράματα παράλυσης J2 και επίδρασης στο βιολογικό κύκλο του νηματώδη. Διαπιστώθηκε αδυναμία ελέγχου του M. incognita που οφείλεται κύρια στην μη επαρκή δραστικότητα της αζαδιραχτίνης στη δόση αυτή και όχι στην αστάθεια του σκευάσματος ή σε διαφορές από την αναγραφόμενη εγγυημένη του σύνθεση, αφού με βάση τη χημική ανάλυση του η περιεκτικότητα της αζαδιραχτίνης στο σκεύασμα βρέθηκε σταθερή, η αναμενόμενη από την ετικέτα. Τέλος, μελετήθηκε το Melia azedarach υπό τη μορφή ενσωματωμένων αλεσμένων καρπών και εκχυλισμάτων και βρέθηκε να προκαλεί παράλυση σε J2 και να αναστέλλει την ολοκλήρωση του βιολογικού κύκλου σε δόσεις χαμηλές. Στo πλαίσιo μιας προσπάθειας συσχέτισης της νηματωδοκτόνου δράσης του εκχυλίσματος του Melia azedarach εναντίον του M. incognita, έγινε απομόνωση και ταυτοποίηση των λιμονοειδών εκείνων που συμμετείχαν σε μεγαλύτερη αναλογία στη σύσταση του. Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν για το χρωματογραφικό διαχωρισμό και την ταυτοποίηση ήταν η χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC), η χρωματογραφία στήλης (CC), η τεχνική υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC), η τεχνική υγρής χρωματογραφίας με φασματoμετρία μάζας (LC-MS), η τεχνική υγρής χρωματογραφίας υψηλής ακρίβειας με φασματόμετρο μάζας με υβριδικό αναλυτή τετράπολου–χρόνου πτήσης (Q-TOF) και η τεχνική πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού ¹H και ¹³C (NMR).