Εφαρμογές τεχνικής χρωματογραφίας HPLC με ανιχνευτή σκέδασης ακτινοβολίας στον έλεγχο γλυκοσιδών αντιβιοτικών

Abstract

Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) is increasingly being used in LC as a quasi-universal detector eliminating the need for derivatization of non-absorbing analytes. Its ability to perform quantitation of substances with lack of standard material, since it shows nearly equal response factors for molecules with about equal molecular mass and similar structure formula, is well-established. In the field of pharmaceutical analysis, it has already been proposed as an effective alternative for the determination of, among others, cyclodextrins, polyethylene glycols, products of combinatorial and parallel synthesis and inorganic ions, including sulfates in gentamicin raw material. Aminoglycosides contain one or more aminosugars, such as glucosamine or neosamine, linked by glycoside linkages to a basic (amino or guanidino) 6-membered carbon ring (eg. streptidine or streptamine). They may be classified as broad spectrum-antibiotics with greater activity against gram-negative than gram-positive bacteria. Various HPLC methods have been proposed for the determination of aminoglycosides but due to the low UV absorptivity and the absence of native fluorescence, pre-column or post-column derivatization is required. HPLC methods with electrospray ionization/ion-trap tandem mass spectrometry, pulsed electrochemical detector and laser-based polarimeter have also been reported. In this study novel HPLC-ELSD methods with Waters C18 Spherisorb ODS-2 4.6?250 mm analytical column were developed and validated for the direct determination of: a) the four major gentamicins, b) neomycin, c) kanamycin A and kanamycin B and d) tobramycin along with the inorganic co-ion (sulfate). No derivatization step was required, and the applicability of the developed methods to various matrices (raw materials, formulations, bacteria culture medium, animal feedings, plasma and urine) was examined. Gentamicin (sulfate) mainly consists of four closely related components designated as C1, C1a, C2 and C2a. The lack of reference standard material makes the direct quantitation of individual components quite difficult, and the chemical analysis is limited to the determination of the relative fraction of each component from the area of the chromatographic peaks (which is influenced by the differences of the absorptivity among the various components derivatives). In this study Multivariate Simplex algorithm was applied for the final optimization of the composition and the flow rate of the mobile phase. Six response variables were evaluated (peak areas, precision, asymmetry, resolution, retention time of the first and the final peak). The algorithm stopped after 16 experiments. Best results were obtained using a mobile phase of H2O/MeOH/ACN 990/5/5 containing 0.88 ml TFA and 35 mg TCA per liter, in an isocratic mode at a rate of 1.1 ml/min. After univariate optimization evaporation temperature was selected to be 50 oC and pressure of carrier gas (N2) 3.0 bar. Gentamicin components C1a, C2, C2a and C1 are eluted at 4.6, 5.9, 7.1 and 8.7 min, respectively with asymmetry factor 1.4-2.0 and good resolution (Rs > 1.5). Logarithmic calibration curves (from 4-7 to 50-90 μg/ml) was obtained for each component (r > 0.999). Limit of detection was ranged from 4 to 7 μg/ml and precision (%RSD, n= 4) 0.4-2.2. Kanamycin (sulfate), another aminoglycoside antibiotic available at high purity, is eluted at 3.2 min and it is well-separated from gentamicin C1a (R=1.6). The equivalence of responses of gentamicin components and kanamycin to ELS detection (proven by t-test) allows the use of kanamycin as standard substance for the direct quantitation of gentamicin components. Also the simultaneous determination of sulfate was feasible (LOD= 1.4 μg/ml, %RSD= 0.18, r> 0.994). The proposed method was applied for the determination of gentamicin in pharmaceutical formulations (injection, eye drops and cream). The only pretreatment step was the appropriate dilution with the mobile phase, except for cream, which a liquid - liquid extraction was required. Dilution experiments revealed the absence of interference from exipients (constant and proportional errors) and recovery from standard addition experiments was ranged from 99-102% and precision (%RSD, n= 3) 1.4-2.3. ....................................................................................................................................................

Ο εξατμιστικός ανιχνευτής σκέδασης ακτινοβολίας (ELSD) χαρακτηρίζεται ως ημιγενικός ανιχνευτής, συμβατός με συστήματα HPLC. Ως εκ τούτου, εμφανίζει την ικανότητα, σε αντίθεση με τους ανιχνευτές φθορισμού και UV/Vis, να ανιχνεύει άμεσα τα αμινογλυκοσιδικά αντιβιοτικά, χωρίς να απαιτείται στάδιο παρασκευής παραγώγων. Παράλληλα, εμφανίζει την ικανότητα της ταυτόχρονης ανίχνευσης, των συνοδευτικών ανόργανων ανιόντων, τα οποία, εφόσον υπάρχουν, είναι τα θειικά. Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν αναλυτικές μέθοδοι βασιζόμενες στην τεχνική HPLC/ELSD για τον ποσοτικό προσδιορισμό αμινογλυκοσιδικών αντιβιοτικών (γενταμικίνη, νεομυκίνη, καναμυκίνη και τοβραμυκίνη) σε διάφορα δείγματα (πρώτες ύλες, σκευάσματα, ζωοτροφές, θρεπτικά υλικά καλλιέργειας μικροβίων και βιολογικά υγρά). Τα χαρακτηριστικά ποιότητας του χρωματογραφικού διαχωρισμού των τεσσάρων κύριων συστατικών της γενταμικίνης, με στήλη Waters C18 Spherisorb ODS-2, εμφανίζουν τις βέλτιστες τιμές με σύσταση κινητής φάσης H2O / MeOH / ACN: 990 / 5 / 5 που περιέχει 0,88 ml TFA και 35 mg TCA ανά λίτρο, υπό ισοκρατική έκλουση με ροή 1,1 ml/min, όπως προέκυψε από μελέτη βελτιστοποίησης βασιζόμενη στον αλγόριθμο της πολυπαραμετρικής τροποποιημένης Simplex. Η βέλτιστη θερμοκρασία εξάτμισης της κινητής φάσης εντός του ανιχνευτή είναι 50 οC και η βέλτιστη πίεση του φέροντος αερίου 3,0 bar. Χρησιμοποιώντας τις παραπάνω χρωματογραφικές συνθήκες η διαχωριστότητα μεταξύ των κορυφών των συστατικών της γενταμικίνης είναι από 1,5 έως 4,8 και ο παράγοντας ασυμμετρίας υπολογιζόμενος στο 5% του ύψους από 1,4 έως 2,0. Η μη διαθεσιμότητα πρότυπων ουσιών των τεσσάρων κύριων συστατικών της γενταμικίνης καθιστά μη εφικτή την κατασκευή καμπυλών βαθμονόμησης εξωτερικού προτύπου και δεν επιτρέπει τον άμεσο ποσοτικό τους προσδιορισμό με τις υπάρχουσες χρωματογραφικές μεθόδους. Η προτεινόμενη HPLC/ELSD μπορεί να επιτύχει τον άμεσο ποσοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων κύριων συστατικών της γενταμικίνης βασιζόμενη στην ισοδυναμία, όπως αποδείχτηκε, των συντελεστών απόκρισης στον ανιχνευτή ELSD των τεσσάρων κύριων συστατικών της γενταμικίνης και ενός όμοιας δομής αμινογλυκοσιδικού αντιβιοτικού ενός συστατικού, της καναμυκίνης Α. Η ποσοτική συσχέτιση του εμβαδού των χρωματογραφικών κορυφών και της ποσότητας της ουσίας είναι σε κάθε περίπτωση λογαριθμική, με ικανοποιητικό συντελεστή συσχέτισης (r2 > 0,99). Το όριο ποσοτικοποίησης κυμαίνεται από 3,9 μg/ml έως 7,2 μg/ml. Η προταθείσα μέθοδος εφαρμόστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων κύριων συστατικών της γενταμικίνης και των θειικών σε πρώτες ύλες και φαρμακευτικά σκευάσματα (ενέσιμο διάλυμα, οφθαλμικές/ωτικές σταγόνες και κρέμα). Στην περίπτωση των πρώτων υλών, τα λαμβανόμενα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τη μέθοδο της Φαρμακοποιίας (μέθοδος κανονικοποίησης). Τα αποτελέσματα της περιεκτικότητας των θειικών δεν παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο μεθόδους. Ομοίως, στα συστατικά C2 και C2a δεν εμφανίζεται στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο μεθόδους, ενώ τα αποτελέσματα για τα συστατικά C1a και C1 εμφανίζουν απόκλιση, οφειλόμενη κυρίως στο γεγονός ότι η μέθοδος της Ευρωπαϊκής Φαρμακοποιίας επηρεάζεται από τις διαφορές της απορροφητικότητας των παραγώγων στο χρησιμοποιούμενο μήκος κύματος (330 nm). ...........................................................................................................................................................