Δομική ανάλυση βιομορίων που αλληλεπιδρούν με πυρηνικά οξέα

Abstract

R.PvuII is a restriction enzyme which belongs to the Type II restriction enzymes category and cleaves the palindrome sequence CAT/CTG, leaving blunt ends. scPvuII is the only restriction enzyme up to date which has been converted from its natural homodimeric form into a single polypeptide chain by tantemly linking the two subunits through a short peptide linker while maintaining its catalytical properties. Several scPvuII mutants targeted in residues with binding and catalytic implications have been designed, cloned and produced in order to study the structural and biochemical propertie's of the enzyme. Our objective was the construction of restriction enzymes which recognize asymmetrical sequences of oligonucleotides. All the mutants has been crystallized with the "hanging drop method" and the collection of the crystallographic data has been in the EMBL-DESY synchrontron. The solution of the X-ray structures was done using the program MOLREP (Vagin & Teplyakov, 1997). All mutants crystallize in space groups P2 and P4₂. In binding assays in polyacrylamide non-denaturing gels, in the presence of CaCI₂ and with three dsDNAs of different lengths with the cognate sequence, different results for each of the mutations have been observed. In this way we have studied the significance for recognition and binding with the cognate DNA of the aminoacid residues that have been replaced. In cleavage assays in polyacrylamide non-denaturing gels in the presence of the cofactor MgCI₂ and with three dsDNAs of different lengths with the cognate sequence, we have observed different results for each one of the mutant proteins and in comparison with the wild-type enzyme, scPvuII. The importance of the length of the cognate DNA has been shown. Cleavage assays with supercoiled plasmid DNA in agarose gels in the presence of the MgCI₂ cofactor, has shown that the manner and the duration of cleavage is different for each mutant. The most interesting case is that of a double mutant (D34G/K70A) which seems to cleave the supercoiled plasmid DNA in a non symmetrical way. Measurements with SAXS (Small Angle Scattering, Svergun, D. I., Petoukhov 2001) in EMBL-DESY synchrontron, have shown that the mutant proteins do not display important differences in comparison with the wild type scPvuII protein, a fact that is in agreement with the crystallographic analysis.

Η R.PvuII είναι μία περιοριστική ενδονουκλεάση που ανήκει στην κατηγορία των Τύπου II περιοριστικών ενδονουκλεασών, και καταλύει την παλίνδρομη αλληλουχία CAT/CTG, αφήνοντας τυφλά άκρα. Είναι το μόνο μέχρι σήμερα περιοριστικό ένζυμο που μετατράπηκε από την ομοδιμερή μορφή του σε μονομερές με την προσθήκη ενός πεπτιδικού linker, GlySerGlyGly, διατηρώντας ταυτόχρονα τις καταλυτικές του ιδιότητες. Σχεδιάστηκαν, κλωνοποιήθηκαν και παράχθηκαν διάφορες στοχευμένες μεταλλάξεις σε αμινοξικά κατάλοιπα που έχουν σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση και κατάλυση, με σκοπό την περαιτέρω δομική και βιοχημική μελέτη του ενζύμου αυτού. Στόχος μας ήταν η δημιουργία περιοριστικών ενζύμων που να αναγνωρίζουν ασύμμετρες αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων. Οι μεταλλάξεις κρυσταλλώθηκαν με τη «μέθοδο της κρεμαστής σταγόνας» και η συλλογή των κρυσταλλογραφικών δεδομένων έγινε στο συγχροτρόνιο του EMBL-DESY. Η επίλυση των κρυσταλλογραφικών δομών τους έγινε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MOLREP (Vagin & Teplyakov, 1997). Τα κρυσταλλικά συστήματα που ανήκουν είναι το Ρ2 και το Ρ4₂. Σε πειράματα πρόσδεσης με μη αποδιατακτικά πηκτώματα πολυακρυλαμίδης παρουσία CaCI₂ με τρία διαφορετικά μήκη συγγενούς DNA, παρατηρήθηκαν διαφορετικά αποτελέσματα για κάθε μία από τις μεταλλάξεις και με αυτό τον τρόπο μελετήθηκε η σημαντικότητα που έχουν τα αμινοξικά κατάλοιπα που αντικαταστάθηκαν για την αναγνώριση και πρόσδεση στην συγγενή αλληλουχία του DNA. Σε πειράματα κατάλυσης με μη αποδιατακτικά πηκτώματα πολυακρυλαμίδης παρουσία του απαραίτητου συμπαράγοντα MgCI₂ με τρία διαφορετικά μήκη συγγενούς DNA, η συμπεριφορά των μεταλλαγμένων ενζύμων διαφοροποιείται, τόσο μεταξύ τους όσο και με την scPvuII και καθοριστικό ρόλο έχει το μήκος του συγγενούς DNA που χρησιμοποιείται κάθε φορά. Πειράματα κατάλυσης με υπερελικωμένο πλασμιδιακό DNA σε πηκτώματα αγαρόζης παρουσία του απαραίτητου συμπαράγοντα MgCI₂, έδειξαν ότι ο τρόπος και η διάρκεια κατάλυσης διαφέρει για το καθένα από αυτά. Η περισσότερο ενδιαφέρουσα περίπτωση είναι αφορά μία συγκεκριμένη μετάλλαξη που φαίνεται να καταλύει με μη συμμετρικό τρόπο το DNA. Από μετρήσεις που έγιναν με την μέθοδο SAXS (Small Angle Scattering, Svergun, D. I., Petoukhov 2001) στο συγχροτρόνιο του EMBL-DESY, φαίνεται ότι οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερες διαφοροποιήσεις σε σχέση με την scPvuII, γεγονός που συμφωνεί και με την ανάλυση των κρυσταλλογραφικών δεδομένων.