Διερεύνηση των συνθηκών παραγωγής βακτηριοσινών από στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από αλλαντικά αέρος και μελέτη των ιδιοτήτων τους

Abstract

Preliminary screening with microorganisms isolated from meat products, led to the selection of three strains (Pediococcus acidilactici NRRL B5627, Pediococcus pentosaceus Mees 1934, and Lactobacillus plantarum ΑΤΗ) based on the antimicrobial character of their culture broths. P. acidilactici NRRL B5627 produced a bacteriocin of 3.66 kDa, designated as pediocin SA-1. Pediocin SA-1 was resistant to proteases, maintained activity at wide ranges of pH, exhibited stability to heat and cold treatments and was inhibitory to most Gram⁺ bacteria, including Listeria monocytogenes. It was produced as a primary metabolite and its specific production was enhanced under semi-aerobic culture conditions (60% DOT), suggesting the involvement of an oxidative metabolic pathway in its biosynthesis. Its production was enhanced when the carbon source of the substrate was glucose. This effect was studied on batch and fed-batch cultures, to find that the initial concentration of glucose, as well as its maintained stable concentration throughout the fermentation, affected the specific productivity of bacteriocin and the overall process productivity. Production of pediocin SA-1 was also studied on a meat simulation medium with various concentrations of NaNO₂. At 5 ppm, a common concentration in most European type dry sausages, under anaerobic conditions, NaNO₂ had no effect on the production of bacteriocin, lactic acid and biomass. P. pentosaceus Mees 1934 produced a bacteriocin of 5.37 kDa, designated as pediocin SM-1. SM-1 was inactivated when treated with proteolytic enzymes, maintained stability at high and low temperatures and at wide ranges of pH and was inhibitory to Gram+ bacteria including L. monocytogenes. It was produced as a primary metabolite and its specific productivity was enhanced under semi-aerobic conditions. The performance of P. pentosaceus, which is a probiotic microorganism, was studied in food-grade encapsulation systems in oil-in-water emulsions, in terms of viability at adverse micro-environmental conditions. The microorganism was encapsulated in microspheres (~2 μm diameter) of olive and corn oils, which were either stabilized with xathan and peptone peptides or emulsified with pectin. The applied methodology permitted encapsulation yields >65% of the initial population and viability percentages >82% in a period of thirty days. Microcapsules remained intact following treatment with simulated gastric juice and >87% of the encapsulated were delivered in simulated intestinal juice as viable free cells. Viability estimates for free and encapsulated cells were obtained, after treatment with trypan blue stain, in real time through the data generated by an automatic image analysis system that employed phase contrast microscopy. Lactobacillus plantarum ΑΤΗ, produced also a bacteriocin (ΑΤΗ), a glycoprotein of ~30 kDa, with a wide antimicrobial spectrum against Gram⁺ bacteria including L. monocytogenes. Its activity was strongly related to the cell wall of Lb. plantarum, it was heat labile, maintained activity at a wide range of pH and was inactivated in the presence of proteolytic, lipolytic and glycolytic enzymes. Its specific productivity was enhanced in environments of low oxygen delivery in which it was produced as a primary metabolite.

Προκαταρκτικές μελέτες σε μικροοργανισμούς που απομονώθηκαν από αλλαντικά αέρος, οδήγησαν στην επιλογή τριών στελεχών (Pediococcus acidilactici NRRL Β5627, Pediococcus pentosaceus Mees 1934, και Lactobacillus plantarum ΑΤΗ), με κριτήριο τον ισχυρό αντιμικροβιακό χαρακτήρα του ορού των καλλιεργειών τους. Ο P. acidilactici NRRL Β5627 παράγει μια βακτηριοσίνη, μοριακού βάρους 3,66 kDa, που ονομάστηκε πεδιοσίνη SA-1. Η πεδιοσίνη SA-1 αποδείχτηκε ανθεκτική σε ορισμένες πρωτεάσες διατήρησε την ενεργότητά της σε μεγάλο εύρος pH, παρουσίασε σταθερότητα σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες και είχε σημαντική αντιμικροβιακή δράση έναντι των Gram⁺ βακτηρίων που εξετάστηκαν, καθώς και της Listeria monocytogenes. Παράχθηκε ως προϊόν πρωτογενούς μεταβολισμού και η ειδική παραγωγή της ενισχύθηκε σε μερικώς αερόβιες συνθήκες (60% DOT), γεγονός που υποδεικνύει ότι η σύνθεση της σχετίζεται με τον οξειδωτικό μεταβολισμό του κυττάρου. Η παραγωγή της ενισχύθηκε παρουσία γλυκόζης ως πηγή άνθρακα στο υπόστρωμα, η επίδραση της οποίας μελετήθηκε σε batch και fed-batch συστήματα καλλιέργειας. Διαπιστώθηκε ότι τόσο η αρχική συγκέντρωση της όσο και τα επίπεδα της σταθερής συγκέντρωσης της επηρέασαν την ειδική παραγωγικότητα σε πεδιοσίνη, αλλά και τη γενικότερη παραγωγικότητα της ζύμωσης. Από τη μελέτη της παραγωγής της πεδιοσίνης SA-1 σε υπόστρωμα προσομοίωσης κρέατος που περιείχε NaN0₂ σε διάφορες συγκεντρώσεις, προέκυψε ότι η συγκέντρωση των 5 ppm, συνήθης συγκέντρωση στα ευρωπαϊκού τύπου αλλαντικά αέρος, υπό αναερόβιες συνθήκες, δεν επιδρά στην παραγωγή πεδιοσίνης, βιομάζας και γαλακτικού οξέος. Ο P. pentosaceus Mees 1934 παράγει μια βακτηριοσίνη, μοριακού βάρους 5,37 kDa, που ονομάστηκε πεδιοσίνη SM-1. Η SM-1 αδρανοποιήθηκε παρουσία πρωτεασών, διατήρησε την ενεργότητά της σε μεγάλο εύρος pH, παρουσίασε σταθερότητα σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες και είχε σημαντική αντιμικροβιακή δράση έναντι των Gram⁺ βακτηρίων που εξετάστηκαν, καθώς και της L. monocytogenes. Παράχθηκε ως προϊόν πρωτογενούς μεταβολισμού και η ειδική παραγωγή της ενισχύθηκε σε μερικώς αερόβιες συνθήκες. Η συμπεριφορά του P. pentosaceus που αποτελεί προβιοτικό μικροοργανισμό, μελετήθηκε σε συστήματα εγκαψυλλίωσης των κυττάρων σε γαλακτώματα ελαίου σε νερό με στόχο τη διασφάλιση προστασίας σε αντίξοες συνθήκες μικρο-περιβάλλοντος. Ο μικροοργανισμός εγκαψυλλιώθηκε σε μικροσφαιρίδια ελαιόλαδου και αραβοσιτέλαιου (διαμέτρου ~2 μm), σταθεροποιημένα με ξανθάνη και πεπτίδια πεπτόνης, ή με γαλακτωματοποιητή την πηκτίνη. Με τη μεθοδολογία που ακολουθήθηκε επιτεύχθηκε εγκαψυλλίωση των κυττάρων του αρχικού πληθυσμού σε ποσοστό >65%, και βιωσιμότητα σε διάστημα 30 ημερών >82%. Οι μικροκάψουλες αποδείχτηκαν ανθεκτικές σε διάλυμα προσομοίωσης γαστρικού υγρού και >87% των εγκαψυλλιωμένων κυττάρων παραλήφθηκαν ελεύθερα και σε βιώσιμη κατάσταση. Τα ποσοστά βιωσιμότητας των ελεύθερων ή εγκαψυλλιωμένων κυττάρων στα γαλακτώματα υπολογίστηκαν σε πραγματικό χρόνο μετά από χρώση με κυανό του τρυπανίου και ανάλυση/επεξεργασία των εικόνων σε σύστημα μικροσκοπικής παρατήρησης αντίθεσης φάσης. Τέλος, ο Lactobacillus plantarum ΑΤΗ παράγει μια βακτηριοσίνη (ΑΤΗ), που είναι γλυκολιποπρωτεΐνη, μοριακού βάρους ~30 kDa, με ευρύ αντιμικροβιακό φάσμα έναντι Gram⁺ βακτηρίων συμπεριλαμβανομένης και της L. monocytogenes. Το μεγαλύτερο μέρος της ενεργότητάς της σχετιζόταν με το κυτταρικό τοίχωμα του Lb. plantarum, ήταν θερμοευαίσθητη, διατηρήθηκε ενεργή σε μεγάλο εύρος pH, ενώ αδρανοποιήθηκε παρουσία πρωτεολυτικών, λιπολυτικών και γλυκολυτικών ενζύμων. Η ειδική παραγωγή της ενισχύθηκε σε περιβάλλον μειωμένης παροχής οξυγόνου όπου παράχθηκε ως πρωτογενής μεταβολίτης.