Μελέτη μηχανισμών τοπογένεσης διαμεμβρανικών μεταφορέων στον Aspergillus nidulans

Abstract

Apart from being precursors of proteins, amino acids can support growth of microbial organisms, are involved in osmoregulation in plants and neurotransmission in mammals. Amino acid uptake from the extracellular environment is mediated by specific polytopic transmembrane proteins of the plasma membrane, also known as amino acid transporters. The study of amino acid transporters is so far focused on model microbial systems, such as the ascomycetes Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus nidulans, where genetic, molecular and biochemical approaches are more easily applied compared to higher eukaryotes. Fungal amino acid transporters are members of the evolutionary conserved APC (Amino acid Polyamine organoCation) superfamily. In A. nidulans, three transporters have been characterized in a genetic level: the major proline transporter PrnB, the γ-amino butyric transporter GabA and the acidic amino acid transporter AgtA. Limited information is available concerning the post-translational targeting of these proteins to the plasma membrane (topogenesis), the physiological regulation of this process, as well as the cis-regulatory elements and the trans-protein components that coordinate it. During the present PhD thesis, A. nidulans strains expressing functional chimeric AgtA-sGFP transporters have been isolated. In the presence of poor nitrogen sources, such as urea or acidic amino acids, the chimeric molecules AgtA-sGFP are localized in the plasma membrane and the vacuoles of the fungal germlings. Vacuoles are the final destination of these proteins where they become degraded. Addition of a rich nitrogen source, like ammonium, in the growth medium induces the endocytosis of the AgtA-sGFP molecules and their targeting to the vacuoles. Additionally, the shrA gene of A. nidulans has been cloned by in silico analysis and functionally characterized. ShrA is an ER transmembrane protein. The shrA gene expression is constitutive. Deletion of the respective genetic locus causes significant decrease in the ability of A. nidulans to take up proline and aspartate from the growth medium. In the shrAΔ genetic background, the chimeric transporters PrnB-sGFP and AgtA-sGFP are not being properly targeted to the plasma membrane, but remain blocked in intracellular compartments. Thus, ShrA is involved in the post- translational expression of the proline and aspartate transporters in A. nidulans. The shrA cDNA clone also complements the yeast shr3Δ mutation partially. In conclusion, the ShrA protein of A. nidulans is an orthologue of the yeast Shr3p, a molecular chaperon acting at the level of ER exit, specific exclusively for the amino acid transporter family. Further investigation of the genetic or physical interactions in which the ShrA protein is involved may reveal new cis- or trans-factors regulating the topogenesis of amino acid transporters in A. nidulans.

Τα αμινοξέα, εκτός από την πρωτεϊνοσύνθεση, εμπλέκονται σε μια σειρά βιολογικών διεργασιών (μικροβιακή αύξηση, οσμωπροστασία στα φυτά, νευροδιαβίβαση στα θηλαστικά). Η πρόσληψη των αμινοξέων από το εξωτερικό περιβάλλον πραγματοποιείται από εξειδικευμένες πολυτοπικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης, τους μεταφορείς αμινοξέων. Έως τώρα, η μελέτη των μεταφορέων αμινοξέων έχει επικεντρωθεί σε πρότυπα μικροβιακά συστήματα, όπως οι ασκομύκητες Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus nidulans, όπου οι γενετικοί, μοριακοί και βιοχημικοί χειρισμοί καθίστανται ευκολότεροι σε σχέση με τους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι μεταφορείς αμινοξέων των μυκήτων είναι μέλη της συντηρημένης σε όλα τα βασίλεια υπεροικογένειας APC (Amino acid/Polyamine/organoCation). Στον A. nidulans τρεις μεταφορείς αμινοξέων έχουν χαρακτηριστεί σε γενετικό επίπεδο: ο κύριος μεταφορέας προλίνης PrnB, ο μεταφορέας γ-αμινοβουτυρικού οξέος GabA και ο μεταφορέας όξινων αμινοξέων AgtA. Ελάχιστα είναι γνωστά όσον αφορά τη μετα-μεταφραστική στόχευση των πρωτεϊνών αυτών στην πλασματική μεμβράνη (τοπογένεση), καθώς και τις περιβαλλοντικές συνθήκες, τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία και τους trans-πρωτεϊνικούς παράγοντες που τη ρυθμίζουν. Στα πλαίσια της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής, απομονώθηκαν στελέχη του Α. nidulans που εκφράζουν λειτουργικούς χιμαιρικούς μεταφορείς AgtA-sGFP. Παρουσία δευτερευουσών πηγών αζώτου, όπως είναι η ουρία ή τα όξινα αμινοξέα, τα χιμαιρικά μόρια AgtA-sGFP εντοπίζονται στην πλασματική μεμβράνη και τα χυμοτόπια των εκβλαστημένων κονιδιοσπορίων. Τα χυμοτόπια αποτελούν θέσεις αποικοδόμησης των μορίων του μεταφορέα στα πλαίσια της φυσιολογικής τους ανακύκλωσης. Η προσθήκη ιόντων αμμωνίου, μίας κύριας πηγής αζώτου, στο θρεπτικό υπόστρωμα επάγει την ενδοκύτωση των μορίων AgtA-sGFP και τη μεταφορά τους στα χυμοτόπια. Επιπλέον, μετά από in silico ανάλυση, κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε λειτουργικά το γονίδιο shrA του Α. nidulans. Η πρωτεΐνη ShrA είναι διαμεμβρανική και εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο του κυττάρου. Η έκφραση του γονιδίου shrA είναι συστατική. Η εξάλειψη του γενετικού τόπου shrA από το γονιδίωμα του Α. nidulans προκαλεί μείωση της ικανότητας πρόσληψης προλίνης και ασπαρτικού οξέος από το θρεπτικό υπόστρωμα. Σε γενετικό υπόβαθρο shrΑΔ, οι χιμαιρικοί μεταφορείς PrnB-sGFP και AgtA-sGFP δεν στοχεύονται στην πλασματική μεμβράνη, αλλά παραμένουν σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα. Συνεπώς, η πρωτεΐνη ShrA εμπλέκεται στη μετα-μεταφραστική έκφραση των μεταφορέων προλίνης και ασπαρτικού οξέος του Α. nidulans. Επιπλέον, ο κλώνος cDNA του γονιδίου shrA συμπληρώνει μερικώς τη μεταλλαγή shr3Δ της ζύμης. Συνεπώς, η πρωτεΐνη ShrA είναι ορθόλογη της πρωτεΐνης Shr3 της ζύμης, η οποία δρα ως μοριακή συνοδός κατά την έξοδο από τη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου για τους μεταφορείς αμινοξέων αποκλειστικά. Η διερεύνηση των φυσικών ή γενετικών αλληλεπιδράσεων στις οποίες εμπλέκεται η πρωτεΐνη ShrA μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση νέων cis- και trans-παραγόντων που ρυθμίζουν την τοπογένεση των μεταφορέων αμινοξέων στον A. nidulans.