Μελέτη των φωσφοϊνοσιτιδίων του μονοκύτταρου ευκαρυωτικού οργανισμού tetrahymena: συμμετοχή στη μεταγωγή σήματος και την κυκλοφορία μεμβρανών

Abstract

Phosphoinositides, the phosphorylated derivatives of phosphatidylinositol (PtdIns), are important regulators of eukaryotic cell functions including signal transduction, cell survival/proliferation and membrane and protein trafficking. Additional to the established signalling pathway known as PI cycle, which proceeds through hydrolysis of D4-phosphoinositides by agonist-induced activation of a specific phospholipase C (PI-PLC), novel functions are continously assigned to phosphoinositides. Recent additions are the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signalling pathway and the establishment of functional in vivo protein-phosphoinositide interactions via specific protein domains (PH, FYVE, PX, ENTH, FERM) which dictate protein function and/or their localization to specific subcellular membranes or cytoskeletal structures. This thesis introduces a unicellular eukaryotic organism, the ciliated Tetrahymena, into the phosphoinositide research field. The main goals of this study were (a) the characterization of phosphoinositides in Tetrahymena and (b) the identification of their possible roles in the regulation of signal transduction (PI cycle) and membrane trafficking. Tetrahymena posseses three well characterized membrane trafficking pathways, regulated exocytosis of dense-core granules, constitutive secretion of lysosomal acid hydrolases and phagocytosis. Recent experimental advances in the genetic manipulation of Tetrahymena as well as its “high priority ranking” in genome sequencing projects highlight the use of this organism as a model eukaryotic cell in both biochemical and molecular research. T.pyriformis PtdIns was characterized by in vivo labelling with [3H]-myo-inositol and TLC, mild alkaline hydrolysis and Dowex chromatography, and by 1HNMR analysis. PtdIns was found to be a diacylglycerol phospholipid esterified mainly with myristic and palmitic acids. Comparative analysis of the fatty acid profiles of PtdCho and PtdEth showed that PtdIns is probably produced via a distinct PtdOH pool. In order to identify positional isomers of Tetrahymena PtdInsP and PtdInsP2, a method utilizing methylamine-deacylation of [3H]inositol-labelled phosphoinositides and HPLC separation of the corresponding glycerophosphoinositol phosphates was developed. Standard [3H]PtdIns3P and [3H]PtdIns4P were isolated from S.cerevisiae cultures labelled in vivo with [3H]inositol. Analysis of Tetrahymena PtdInsP showed that PtdIns3P is constitutively present in this organism and accounts for ~16 % of the total PtdInsP pool, a value higher than that of mammalian cells. In addition, analysis of PtdInsP2 showed the presence of PtdIns(4,5)P2 and a second phosphoinositide, which accounted for ~30% of the total PtdInsP2 pool and was tentatively identified as PtdIns(3,5)P2. This is the first report of D3-phosphoinositide presence in an organism more dinstantly related to animals than fungi. Treatment of T.pyriformis cells with mammalian PI3K inhibitors, wortmannin (WT) and LY294002, showed an inhibition of Tetrahymena phosphoinositide synthesis in vivo. WT (0.1-10 μΜ) caused a rapid, within 10 min, depletion of PtdIns3P and PtdIns(3,5)P2 levels, which after tretament accounted for ~15 % of control. In contrast to WT, treatment of cells with LY294002 (50 and 100 μΜ) caused a slight reduction of PtdIns4P levels (20-35 %) while PtdIns3P, PtdIns(3,5)P2 and PtdIns(4,5)P2 levels remained unaffected. These differences are probably due to the different mechanisms of inhibition by these compounds. WT was subsequently used as a specific D3-phosphoinositide synthesis inhibitor in order to investigate the involvement of these lipids in the regulation of Tetrahymena membrane trafficking pathways. Treatment of T.pyriformis cells with wortmannin (0.1-10 μΜ) caused a time and concentration-dependent hypersecretion of two acid hydrolases, acid phosphatase and β-hexosaminidase, while their total activities remained constant. ......................

Tα φωσφοϊνοσιτίδια, παράγωγα της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (PtdIns) φωσφορυλιωμένα από εξειδικευμένες κινάσες σε μια η περισσότερες θέσεις του δακτυλίου της ινοσιτόλης, ρυθμίζουν σε όλους τους μονοκύτταρους και πολυκύτταρους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί λειτουργίες ζωτικής σημασίας όπως η μεταγωγή σήματος, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η κυτταρική επιβίωση/απόπτωση και η ενδοκυτταρική κυκλοφορία μεμβρανών και πρωτεϊνών. Στον κύκλο των φωσφοϊνοσιτιδίων (υδρόλυση D4-φωσφοϊνοσιτιδίων μετά από ενεργοποίηση μιας εξειδικευμένης φωσφολιπάσης C, PI-PLC), με τον οποίο παράγονται ενδοκυτταρικά σήματα, έχουν πρόσφατα προστεθεί: (α) η ανακάλυψη των D3-φωσφοϊνοσιτιδίων που αποτελούν τα ίδια ενδοκυτταρικά σήματα που παράγονται μετά από ενεργοποίηση των 3-κινασών και (β) η απόδειξη ότι τα φωσφοϊνοσιτίδια αλληλεπιδρούν εξειδικευμένα με πρωτεΐνες ή διατηρημένους υποτομείς πρωτεϊνών (PH, FYVE, PX, ENTH, FERM), με αποτέλεσμα είτε την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών, είτε τη μετανάστευση τους σε συγκεκριμένες κυτταρικές μεμβράνες ή κυτοσκελετικές δομές όπου δρούν. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιεί ένα μονοκύτταρο ευκαρυωτικό οργανισμό, το βλεφαριδοφόρο πρωτόζωο Tetrahymena, για να διευκρινίσει με ποιό τρόπο συμμετέχουν τα φωσφοϊνοσιτίδια (και ποιά) σε συγκεκριμένες πορείες κυκλοφορίας μεμβρανών, αλλά και σε πορείες μεταγωγής σήματος (κύκλο φωσφοϊνοσιτιδίων). Η Tetrahymena διαθέτει τρεις καλά χαρακτηρισμένες πορείες κυκλοφορίας μεμβρανών, τη ρυθμιζόμενη εξωκύτωση πυκνών εκκριτικών κοκκίων, τη συστατική έκκριση λυσοσωμιακών όξινων υδρολασών και τη φαγοκύτωση. Ο συγκεκριμένος μικροοργανισμός έχει πρόσφατα αναβαθμισθεί σε σημαντικό κύτταρο-μοντέλο για τη μελέτη λειτουργιών των ευκαρυωτικών κυττάρων, κάτι που υπογραμμίζεται από την έναρξη του προγράμματος αλληλούχισης του γονιδιώματός του. Στην παρούσα εργασία χαρακτηρίστηκαν κατ’αρχάς τόσο η PtdIns της T.pyriformis (με TLC, υδρόλυση και ανάλυση με χρωματογραφία Dowex και 1ΗNMR), όσο και τα φωσφοϊνοσιτίδια (PtdInsP και PtdInsP2) με TLC και χρωματογραφία Dowex, μετά από επισήμανση των κυττάρων με τριτιωμένη ινοσιτόλη. Η PtdIns της Tetrahymena είναι ένα διακυλοφωσφολιπίδιο με κύρια εστεροποιημένα λιπαρά οξέα το μυριστικό και το παλμιτικό και πιθανόν δεν προέρχεται από τη δεξαμενή φωσφατιδικού οξέος των κύριων φωσφολιπιδίων της Tetrahymena. Για την ταυτοποίηση πιθανών ισομερών των PtdInsP και PtdInsP2 αναπτύχθηκε μέθοδος HPLC για το διαχωρισμό των γλυκερο-παραγώγων τους μετά από απακυλίωση με μεθυλαμίνη. Χρησιμοποιώντας πρότυπες ενώσεις απομονωμένες από καλλιέργειες S.cerevisiae, αποδείχθηκε ότι η Tetrahymena περιέχει PtdIns3P σε ποσοστό ~16% της συνολικής PtdInsP, ποσοστό σημαντικά υψηλότερο από αυτό των θηλαστικών. Είναι η πρώτη φορά που εντοπίζονται προϊόντα μιας πιθανής 3-κινάσης σε οργανισμό κατώτερο φυλογενετικά της ζύμης, με την ίδια δε μέθοδο αποδείχθηκε ότι η Tetrahymena διαθέτει και δυο ισομερή της PtdInsP2 (μια πιθανή PtdIns(3,5)P2 εκτός της PtdIns(4,5)P2). Μετά την απόδειξη της παρουσίας D3-φωσφοϊνοσιτιδίων στην Tetrahymena, έγινε μελέτη των συνθηκών κάτω από τις οποίες η σύνθεση των ενώσεων αυτών αναστέλλεται από τους εξειδικευμένους αναστολείς των 3-κινασών, βορτμαννίνης (WT) και LY294002. Η WT, σε συγκεντρώσεις 0.1-10 μΜ προκάλεσε σημαντική πτώση των επιπέδων των PtdIns3P και PtdIns(3,5)P2 (κατά ~85 % σε συγκεντρώσεις 10 μΜ), αλλά όχι των PtdIns4P και PtdIns(4,5)P2, υποδεικνύοντας την in vivo αναστολή μιας πιθανής 3-κινάσης τύπου III. Αντίθετα, το LY294002, σε συγκεντρώσεις μέχρι 100 μΜ, προκάλεσε μικρή πτώση των επιπέδων μόνο της PtdIns4P. Η διαφορά αυτή στη δράση των δυο αναστολέων πιθανώς οφείλεται στο διαφορετικό μηχανισμό αναστολής που χρησιμοποιούν. ......................