Μελέτη της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου με κυτταρομετρία ροής και τετραπλό φθορισμό στις περιπτώσεις Β οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας των ενηλίκων

Abstract

Introduction: The knowledge of the immunophenotypic profile of normal precursor B lymphocytes in bone marrow, known as hematogones, is essential for the recognition of blasts in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (p-B ALL) cases. The immunophenotypic aberrancies of blasts might be related to molecular variations or have prognostic significance or be used for the recognition of the Minimal Residual Disease (MRD). The MRD detection is clinically significant because it helps in identifying patients at risk of relapse.Aim: The aim of the study was to investigate the immunophenotype of blasts in bone marrow or peripheral blood samples of adult p-B ALL patients on diagnosis and evaluate its prognostic significance, its stability after chemotherapy or during relapse and its relation to BCR-ABL hybrid gene presence. Moreover, we examined the ability to detect the fusion BCR-ABL protein with flow cytometry and the prognostic significance of MRD.Material and Methods: Four colour flow cytometry was performed on 199 bone marrow or peripheral blood samples of 30 patients with p-B ALL and on 30 bone marrow samples of 30 patients with other types of acute leukemia apart from p-B ALL (control group).Results: The study of the control group defined the immunophenotypic profile of normal precursor B lymphocytes according to maturation stage. Common immunophenotypic characteristic of all stages was the presence of CD10, CD19, CD22 and CD38 antigens. Leukemia Associated ImmunoPhenotype (LAIP) was detected in 86.6% of the p-B ALL cases. The low expression of CD45 antigen was associated with less frequent detection of MRD>5% (p<0.05). On the contrary CD20 expression in the subgroup of newly diagnosed patients emerged as a poor prognosticator (p<0.05). Similar prognostic value was found with regard to the immunophenotype TDT (+)/CD20(+) (p=0.03). The immunophenotypes CD45 weakly positive/CD10(-) and CD10(-)/CD34(+) on newly diagnosed patients were found to be useful in MRD detection as well as in the prediction of disease relapse (p=0.001 and p=0.01, respectively). In addition, the immunophenotype CD10(-)/CD34(+) was found to have indicative, but not statistically significant, relation to mortality. The immunophenotype CD10(+)bright/CD34(+)/CD38(+) was found more often in Ph positive patients compared to patients with normal karyotype (p=0.04). Furthermore, the present study confirmed the ability of BCR-ABL fusion protein detection by flow cytometry. MRD detection before the allogenic bone marrow transplantation tended to characterize patients who relapsed after the transplantation as well as patients who died due to relapse.Conclusion: According to the aforementioned findings, the present study, a) identified immunophenotypes with prognostic value as far as the mortality and relapse is concerned, b) identified a certain immunophenotype in Ph (+) adult p-B-ALL patients and c) confirmed the ability of BCR-ABL fusion protein detection by flow cytometry.

Η γνώση του ανοσοφαινοτυπικού προφίλ των φυσιολογικών πρόδρομων Β λεμφοκυττάρων στο μυελό, των λεγόμενων αιματογονίων, είναι βασική προϋπόθεση για την αναγνώριση και το διαχωρισμό των βλαστικών κυττάρων στις περιπτώσεις Β οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (Β ΟΛΛ). Οι ανοσοφαινοτυπικές αποκλίσεις που παρουσιάζουν τα βλαστικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά αντίστοιχά τους μπορεί να σχετίζονται με συγκεκριμένες μοριακές διαταραχές ή να έχουν προγνωστική αξία για την έκβαση του νοσήματος. Επιπλέον, μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης του ασθενούς για την αναγνώριση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (Minimal Residual Disease, MRD), των βλαστικών δηλαδή κυττάρων που παραμένουν στο μυελό μετά τη θεραπεία. Ο προσδιορισμός της MRD έχει κλινική σημασία γιατί αξιολογεί το αποτέλεσμα της θεραπείας και διακρίνει τους ασθενείς με κίνδυνο υποτροπής της νόσου. Σκοπός της διατριβής ήταν η ανοσοφαινοτυπική μελέτη των βλαστικών κυττάρων στο μυελό ή το περιφερικό αίμα ενήλικων ασθενών με Β ΟΛΛ κατά τη διάγνωση, η ανίχνευση της MRD κατά τη διάρκεια της θεραπείας σε δείγματα μυελού και η αξιολόγηση της κλινικής της σημασίας. Μελετήθηκαν οι επιμέρους ανοσοφαινοτυπικοί δείκτες κάθε περίπτωσης Β ΟΛΛ και εξετάστηκε η πιθανή προγνωστική τους αξία ως προς την έκβαση του νοσήματος, η σταθερότητά τους μετά τη χορήγηση χημειοθεραπείας ή κατά την υποτροπή, η σχέση τους με την παρουσία του BCR-ABL γονιδίου, η δυνατότητα ανίχνευσης της υβριδικής BCR-ABL πρωτεΐνης με την κυτταρομετρία ροής καθώς και η προγνωστική σημασία της MRD ως προς την έκβαση του νοσήματος. Υλικό - Μέθοδος Η ομάδα των ασθενών περιελάμβανε 199 δείγματα μυελού ή περιφερικού αίματος, προερχόμενα από 30 ενήλικες ασθενείς με Β ΟΛΛ. Την ομάδα των μαρτύρων αποτελούσαν 30 δείγματα μυελού των οστών προερχόμενα από ενήλικες ασθενείς με ιστορικό λευχαιμίας διαφορετικού κυτταρικού τύπου από την Β ΟΛΛ. Η μελέτη έγινε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τετραπλούς συνδυασμούς μονοκλωνικών αντισωμάτων συνδεδεμένων με διαφορετικές φθορίζουσες ουσίες και στην περίπτωση ανίχνευσης της υβριδικής BCR-ABL πρωτεΐνης, με ένα νέο kit, που βασίζεται στη σφαιριδομετρία.Αποτελέσματα. Η μελέτη της ομάδας των μαρτύρων καθόρισε το ανοσοφαινοτυπικό προφίλ των φυσιολογικών πρόδρομων Β λεμφοκυττάρων κατά στάδιο ωρίμασης (αιματογόνια σταδίου Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και ώριμα Β λεμφοκύτταρα). Κοινό ανοσοφαινοτυπικό χαρακτηριστικό και των τριών πρόδρομων σταδίων είναι οι παρουσία των αντιγόνων CD10, CD19, CD22 και CD38. Ασύγχρονη συνέκφραση πρώιμων και όψιμων δεικτών ή αποκλίσεις του τύπου υπερ- ή υποέκφραση αντιγόνου, δεν παρατηρήθηκε στα φυσιολογικά πρόδρομα Β λεμφοκύτταρα.Στον πληθυσμό των ασθενών με Β ΟΛΛ που μελετήθηκε, παρατηρήθηκαν ανοσοφαινοτυπικές αποκλίσεις (Leukemia Associated ImmunoPhenotypes, LAIP), κατάλληλες για την αναγνώριση της MRD σε ποσοστό 86.6%. Η χαμηλή ένταση έκφρασης του δείκτη CD45 σχετίζεται με λιγότερες πιθανότητες εμφάνισης υψηλών ποσοστών MRD (p < 0.05). Αντιθέτως, η παρουσία του δείκτη CD20 στους πρωτοδιαγνωσμένους ασθενείς είναι ανεξάρτητος δυσμενής προγνωστικός παράγοντας, καθώς η παρουσία του αυξάνει την πιθανότητα θανάτου (p < 0.05). Ανάλογη προγνωστική σημασία έχει και η συνέκφραση των δεικτών TDT θετικό/CD20 θετικό (p=0.03). Ο ανοσοφαινότυποι CD45 ασθενώς θετικό/CD10 αρνητικό και CD10 αρνητικό/CD34 θετικό στους λεμφοβλάστες των ασθενών κατά την αρχική διάγνωση του νοσήματος χρησιμεύουν αφενός μεν στην ανίχνευση της MRD, αφετέρου στην πρόβλεψη της υποτροπής (p=0.001 και p=0.01, αντιστοίχως). Επιπλέον, ο ανοσοφαινότυπος CD10 αρνητικό/CD34 θετικό φαίνεται να έχει ενδεικτική, αλλά όχι στατικά σημαντική σχέση με τη θνητότητα. Βρέθηκε επίσης σχέση της ανοσοφαινοτυπικής ταυτότητας των βλαστών με το χρωμόσωμα Ph, καθώς ο ανοσοφαινότυπος CD10(+)έντονο/CD34(+)/CD38(+) των βλαστικών κυττάρων ήταν συχνότερος στους ασθενείς με τη συγκεκριμένη καρυοτυπική ανωμαλία σε σύγκριση με τους ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο (p=0.04). Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η δυνατότητα ανίχνευσης της υβριδικής BCR-ABL πρωτεΐνης με την κυτταρομετρία ροής. Η ανίχνευση της MRD πριν τη μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων χαρακτήριζε τους ασθενείς που υποτροπίασαν μετά τη μεταμόσχευση, καθώς και εκείνους που κατέληξαν λόγω της υποτροπής. Συμπέρασμα. Τα ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνδέονται κατά περίπτωση με την πρόγνωση του νοσήματος και μπορεί να είναι ενδεικτικά συγκεκριμένων μοριακών ή καρυοτυπικών διαταραχών, όπως του χρωμοσώματος Ph. Η μέθοδος ανίχνευσης της BCR-ABL υβριδικής πρωτεΐνης στις περιπτώσεις Β ΟΛΛ με την κυτταρομετρία ροής αποδείχθηκε σχετικά εύκολη και αξιόπιστη. Η κυτταρομετρία ροής είναι κατάλληλη τεχνική για την ανίχνευση της MRD, ο υπολογισμός της οποίας έχει αφ’ ενός σημασία στην αξιολόγιση του θεραπευτικού αποτελέσματος και αφ’ ετέρου προγνωστική αξία ως προς την έκβαση του νοσήματος.