Δομική και λειτουργική ανάλυση των πρωτεϊνών BRCA1 και RAD51 σε βιοχημικό, βιοφυσικό και κυτταρικό επίπεδο στο σύστημα καρκίνου του μαστού - ωοθηκών

Abstract

The product of the brca1 gene is central to recombination reactions and thus contributes significantly to maintain the integrity of the genome. BRCA1 protein is strongly involved in DNA repair and cell cycle control through interactions with other partner proteins like BACH1, CtIP, p53 and Rad51. Mutations at the two C-terminal tandem (BRCT) repeats of BRCA1, disrupting BRCA1 interactions with other proteins, were identified in breast tumor patients. Biophysical analysis on the secondary structure, the thermodynamic stability and the modification in binding capacity of the recombinant and purified wt and mutated BRCT domains with BACH1 and CtIP have already been studied in vitro, by employing Circular Dichroism Spectroscopy (CD), Differential Scanning Microcalorimetry (DSC) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Our currently available biophysical experiments clearly demonstrated that certain pathogenic mutations (V1696L, M1652I, M1775K, M1783T, V1809F, P1812A) of the BRCA1-BRCT cause changes in the stability of the domain and influence the binding affinities with synthetic phosphopeptides, corresponding to BACH1 and CtIP binding sites. Moreover based on the interaction parameters of the BRCT-wt and the six variants of this study with pBACH1 and pCtIP were draw the following conclusions: (a) the BRCT-wt bind to both pBACH1 and pCtIP with binding parameters identical to those previously published, (b) in all cases thermally denatured proteins show no binding, (c) the mutants M1783T, P1812A were found to bind to both phosphopeptides, (d) the mutant V1696L binds only to pBACH1, (e) the mutants M1652I, M1775K, V1809F show neither binding to pBACH1 nor to pCtIP like M1775R and R1699W, previously published, (f) the BRCT-wt show stronger affinity with pBACH1 compare with pCtIP. In all CD far-UV spectra of all variants is clear that they perfectly overlap with the corresponding spectrum of the BRCT-wt. In order to investigate the effects of these pathogenic mutations of BRCA1-BRCT in protein’s localization fused GFP-BRCA1 mutants demonstrated and expressed in MCF7 cells. Analysis of the intracellular localization, as well as the co-localization-interactions with p53 and Rad51, were performed with fluorescence microscopy. The experiments in MCF7 have shown a dramatic alteration on their intracellular localization as well as the co-localization with p53, Rad51. The experiments were performed with use of fluorescence microscopy.The current preliminary experiments indicate that pathogenic mutations of BRCT domain with structurally unstable feature in vitro, affect the intracellular localization of the BRCA1 protein and its “cross-talk” with other protein partners. The anticipated results will support the elucidation of the effect of various pathogenic BRCT mutations on the miss-function of BRCA1 nuclear DNA repair replication and cell cycle control at

H ogkokatastaltikή πρωτεΐνη BRCA1 συμμετέχει στις διαδικασίες επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού καθώς και στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, αλληλεπιδρώντας με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών όπως οι BACH1, CtIP, p53 kai Rad51. Metallάξεις του καρβοξυτελικού άκρου της BRCA1, οι οποίες εντοπίζονται σε ασθενείς, επηρεάζουν την ικανότητα αλληλεπίδρασης της BRCA1 με τις πρωτεΐνες BACH1 και CtIP. Stόχος της παρούσας εργασίας είναι ο προσδιορισμός της επίδρασης σημειακών μεταλλάξεων στη δομή και την λειτουργία του BRCA1-BRCT. Για το λόγο αυτό, το καρβοξυτελικό άκρο φυσικού τύπου όσο και τα μεταλλαγμένα, κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν σε προκαρυωτικούς φορείς έκφρασης. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παράχθηκαν σε σταθερή και καθαρή μορφή. Βιοφυσική ανάλυση της δευτεροταγούς δομής και η θερμική σταθερότητα των τμημάτων BRCT, τόσο φυσικού τύπου όσο και των μεταλλαγμένων, πραγματοποιήθηκε με χρήση φασματογράφου κυκλικού διχρωϊσμού (CD) και μικροθερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (DSC). Η ικανότητα αλληλεπίδρασης των BRCA1-BRCTs με συνθετικά φωσφοπεπτίδια,, μελετήθηκε με μικροθερμιδομετρία μοριακής τιτλοδότησης (ITC). Τα αποτελέσματα βιοφυσικής ανάλυσης των μεταλλαγμένων καρβοξυτελικών τμημάτων BRCA1-BRCT (V1696L, M1652I, M1775K, M1783T, V1809F, P1812A) fanerώνουν την αλλαγή στην σταθερότητα του μορίου και την ικανότητα αλληλεπίδρασης με τα συνθετικά φωσφοπεπτίδια (pBACH1, pCtIP). Aπό την θερμοδυναμική ανάλυση των αλληλεπιδράσεων του φυσικού τύπου και των μεταλλαγμένων BRCA1-BRCT sumπeraίνουμε: (a) thn sύνδεση του BRCT-wt me ta πeπtίδια pBACH1 kai pCtIP, (b) thn aπώλεια αλληλεπίδρασης των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών, (γ) οι μεταλλάξεις M1783T, P1812A sundέονται και με τα δύο πεπτίδια, (δ) η μετάλλαξη V1696L sundέεται μόνο με το pBACH1, (e) oi metallάξεις M1652I, M1775K, V1809F emfanίζουν απώλεια της αλληλεπίδρασης με τα δύο πεπτίδια, στ) το φυσικού τύπου καρβοξυτελικό άκρο συνδέεται ισχυρότερα με το pBACH1 se sύγκριση με το pCtIP. Η δευτεροταγής δομή όλων των μεταλλαγμένων τμημάτων, όπως προσδιορίστηκε με την χρήση της τεχνικής κυκλικού διχρωϊσμού, δεν εμφανίζει διαφοροποίηση σε σύγκριση με αυτή του φυσικού τύπου. Sthn πrosπάθεια μας να προσδιορίσουμε την επίδραση των συγκεκριμένων παθογόνων μεταλλάξεων του καρβοξυτελικού άκρου στην ενδοκυτταρική τοπολογία της BRCA1, dhmiourgήθηκαν συζευγμένα μεταλλάγματα του καρβοξυτελικού άκρου της πρωτεΐνης BRCA1 me GFP kai eisacqήκαν σε κύτταρα MCF7. H anάλυση της ενδοκυτταρικής τοπολογίας των GFP-BRCA1-BRCT’s kaqώς και των p53 kai Rad51, πragmatoπoiήθηκε με μικροσκοπία ανάστροφου φθορισμού. Σε in vivo πeirάματα σε κυτταρική σειρά MCF7, πarathrήθηκε shmantikή αλλαγή στην ενδοκυτταρική τοπολογία της ΒRCA1 kai ston endokuttarikό συνεντοπισμό σε σύγκριση με τις πρωτεΐνες p53, Rad51. Ta exacqέντα αποτελέσματα υποδεικνύουν την επίδραση των παθογόνων μεταλλάξεων στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό των μεταλλαγμένων μορίων και δύναται να προσδιορίζουν την αποσταθεροποιητική επίδραση παθογόνων σημειακών μεταλλάξεων του karboxutelikoύ άκρου στην δομή και την λειτουργία thV πrwteΐνης BRCA1.