Μελέτη της ανοσοαπόκρισης μετά την διαδερμική χορήγηση αντιγόνου εγκλεισμένου σε νανόσφαιρες πολυ(γαλακτικού οξέος)

Abstract

The skin is part of the epithelial system of the body, which serves as an effective barrier against a potentially hostile environment. As a structural barrier, the skin keeps water and other vital substances in and foreign material out. As an immunological barrier the skin is rich of immunocompetent cells, such as Langerhans cells. Recent studies have demonstrated the potential of skin as a non-invasive route for administering antigens. In the case of protein antigens, the skin barrier limits the penetration of high molecular weight molecules, preventing their use for therapeutic purposes. However, co-administration of proteins with cholera toxin (CT) has been shown to enhance protein-specific antibody responses. Also, CT was not toxic when applied onto bare skin. Using non-invasive routes such as the skin for vaccine delivery could be advantageous for vaccination for several reasons. The use of needles is avoided, limiting the risk of infections from blood-borne pathogens. Also, the first-pass metabolism is avoided. Finally, transdermal vaccination does not require trained medical personnel and it is expected to be more economical. Subcutaneous delivery of antigen-loaded PLA- and PLGA-microspheres and nanospheres has been found capable of inducing efficient and long-lasting immune responses. In the present study we investigated the immune responses obtained after transcutaneous administration of a model antigen (ovalbumin, OVA) encapsulated in PLA nanospheres. OVA-loaded PLA nanospheres were applied onto bare skin of Balb/c mice in the presence or the absence of CT and the immune responses obtained were compared to those obtained with free OVA (OVA aqueous solution). Also, we investigated the possible route of entry of the nanospheres in the skin. PLA polymer was synthesized by melt polymerization and was characterized by 1H-NMR and gel permeation chromatography (GPC). OVA-loaded nanospheres were prepared by a double emulsion technique and characterized for their size by photon correlation spectroscopy and for antigen loading by the bicinchoninic acid assay. The average size of the nanospheres was 150 nm and the loading with antigen was 10% w/w.

Το δέρμα λειτουργεί σαν μηχανικός φραγμός ενάντια σε ένα εχθρικό περιβάλλον. Παράλληλα λειτουργεί ως ένα ανοσολογικό εμπόδιο, το οποίο είναι πλούσιο σε αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, όπως τα κύτταρα Langerhans. Αν και είναι γενικά παραδεκτό ότι το δέρμα δεν είναι περατό από μεγαλομοριακές ουσίες, και συνεπώς δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως οδός χορήγησης αντιγόνων, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το δέρμα μπορεί να αποτελέσει οδό για τη χορήγηση αντιγόνων. Συγκεκριμένα έδειξαν ότι η διαδερμική χορήγηση ενός αντιγόνου μαζί με την τοξίνη της χολέρας ως ανοσοενισχυτικό επάγει ικανοποιητική ανοσοαπόκριση έναντι του αντιγόνου. Επιπρόσθετα, η διαδερμική χορήγηση της τοξίνης της χολέρας δεν εμφανίζει τοξικότητα όπως με άλλες οδούς χορήγησης. Η διαδερμική χορήγηση εμβολίων εμφανίζει αρκετά πλεονεκτήματα καθώς αποφεύγεται ο μεταβολισμός πρώτης διόδου για τις ουσίες, ενώ παράλληλα αποφεύγεται η χρήση ενέσεων, μειώνοντας τον κίνδυνο μολύνσεων προερχόμενων από το αίμα. Επίσης για την διαδερμική χορήγηση εμβολίων δεν απαιτείται ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό και ο εμβολιασμός μέσω του άθικτου δέρματος αναμένεται να έχει μικρότερο κόστος. Η υποδόρια χορήγηση αντιγόνων εγκλεισμένων σε PLA και PLGA μικροσφαίρες και νανοσφαίρες έχει ευρεθεί ότι επάγει ισχυρή και μακράς διάρκειας ανοσοαπόκριση. Μέχρι σήμερα δεν έχει μελετηθεί η δυνατότητα διαδερμικής χορήγησης αντιγόνων εγκλεισμένων σε πολυμερικά νανοσωματίδια. Έτσι, στην παρούσα μελέτη μελετήθηκε η ανοσοαπόκριση που λαμβάνεται μετά την διαδερμική χορήγηση οβαλβουμίνης (OVA) εγκλεισμένης σε νανοσφαίρες πολύ (γαλακτικού οξέως) (PLA) σε BALB/c μύες με ή χωρίς την συγχορήγηση ανοσοενισχυτικού, της τοξίνης της χολέρας (CT). Επίσης διερευνήθηκε ο πιθανός μηχανισμός εισόδου των νανοσφαιρών στο άθικτο δέρμα των μυών. Για τη παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε σε πρώτο στάδιο σύνθεση πολύ (γαλακτικού οξέως) (PLA) το οποίο χαρακτηρίστηκε ως προς το μοριακό του βάρος με χρωματογραφία διαπέρατοτητας πηκτής και ως προς την καθαρότητα του με 8 φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (1H-NMR). Επίσης νανοσφαίρες PLA με ενκαψακιωμένη οβαλβουμίνη παρασκευάστηκαν με την μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και χαρακτηρίσθηκαν ως προς την μορφολογία με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης, το μέγεθος με την τεχνική σκέδασης φωτός (μέσο μέγεθος 150nm) και ως προς την φόρτωση σε αντιγόνο (μέση φόρτωση 10%) με την μέθοδο του δικιγχονικού οξέος (BCA)