Παραγωγή πολυμερών απο μικροοργανισμούς με τη χρήση υποστρωμάτων παραπροϊόντων βιομηχανιών τροφίμων

Abstract

Starch is, after cellulose, one of the most abundant polysaccharides produced by plants and is composed of amylose (18-33%) and amylopectin (67-82%). Amylose is a linear molecule consisting of α-1,4-linked glucopyranose residues. Amylopectin is a branched polymer containing α-1,6 glycosidic linkages in addition to the α-1,4 bonds. The major use of the polysaccharide is its processing for the production of glucose, which is subsequently used to produce crystalline dextrose, dextrose syrups or high fructose corn syrups. Alternatively, glucose may be fermented to produce other products, such as ethanol, aminoacids and organic acids. However, owing to the complex structure of starch, its hydrolysis requires the coordinate action of several enzymes, such as α-amylase, β-amylase, glucoamylase, α-glucosidase and several debranching enzymes. Endo-acting enzymes, such as α-amylase, hydrolyze linkages in the interior of the starch polymer in a random fashion, which leads to the formation of linear and branched oligosaccharides. α-Amylases are among the most important enzymes and find application in the present-day biotechnology. Although they can be derived from several sources, such as plant or animal tissues and microorganisms, the bacterial α-amylases usually meet the industrial demands. In the present thesis the production of a thermophilic α-amylase from Bacillus subtilis, isolated from fresh sheep’s milk, was studied. More specifically, the effect of various physicochemical factors on the productivity of the amylase was investigated thoroughly. Most notable among these parameters were the initial pH and composition of the growth medium, the type and the concentration of carbon, nitrogen as well as phosphate, the presence of surfactants, concentration of inoculum and the culture temperature. Furthermore, a low cost fermentation medium, containing by-products of the food industry, such as corn steep liquor and cheese whey, was developed for the production of α-amylase. Optimization of the growth medium’s composition was achieved by using the above mentioned by-products and other complex organic nitrogen sources, such as tryptone and yeast extract, in different ratios. In an attempt to improve further the α-amylase production alternative methods, other than submerged fermentation, were investigated, such as the extractive cultivation and the use of immobilized cells. More specifically, extractive cultivation was carried out in aqueous two phase systems, composed of polyethylene glycol (PEG) and dextran and the effect of the concentration of the phase-forming polymers on the distribution of α-amylase between the two phases as well as its overall production was studied. Furthermore, a semi-continuous operation, based on the re-circulation of living cells contained in the dextran-rich bottom phase as well as the PEG-rich upper phase, after of course the extraction of α-amylase from this phase, was developed. High amylase productivity was sustained after 12 successive fermentation batches, raising the cumulative α-amylase production to 600,000 U, while the specific activity of α-amylase produced in this semi-continuous operation was 9 fold higher in comparison to that of the homogeneous system. Immobilization of growing Bacillus subtilis cells in calcium alginate gel capsules resulted in 2-3 fold higher α-amylase productivity in comparison to the free cell cultures. The α-amylase yield and the operational stability of the immobilized system were increased by tailoring the capsules’ characteristics. Furthermore, cell immobilization offered the advantage of using the biocatalysts in a semi-continuous fermentation process and concomitantly raising the cumulative α-amylase production to 2,990,000 U after 15 successive batches. Interestingly, α-amylase production in the above mentioned semi-continuous fermentation processes was enhanced by the presence of corn steep liquor and cheese whey in the growth medium.

Το άμυλο αποτελεί, μετά την κυτταρίνη, έναν από τους πιο άφθονους πολυσακχαρίτες, που παράγεται από τα φυτά και αποτελείται από την αμυλόζη (18-33%) και την αμυλοπηκτίνη (67-82%). Η αμυλόζη είναι ένα γραμμικό μόριο αποτελούμενο από μόρια γλυκόζης ενωμένα με α-1,4-γλυκοζιτικούς δεσμούς. Η αμυλοπηκτίνη πέρα από τους α-1,4-γλυκοζιτικούς δεσμούς φέρει και α-1,6-γλυκοζιτικές διακλαδώσεις. Η κυριότερη εφαρμογή του αμύλου είναι η υδρόλυσή του για την παραγωγή γλυκόζης, η οποία χρησιμοποιείται στη συνέχεια για την παραγωγή κρυσταλλικής γλυκόζης καθώς και αμυλοσιροπίων γλυκόζης και φρουκτόζης υψηλής περιεκτικότητας. Εναλλακτικά η γλυκόζη μπορεί να ζυμωθεί για την παραγωγή άλλων προϊόντων όπως είναι η αιθανόλη, τα αμινοξέα και τα οργανικά οξέα. Ωστόσο, λόγω της πολύπλοκης δομής του αμύλου η υδρόλυσή του απαιτεί τη συνδυασμένη δράση αρκετών αμυλολυτικών ενζύμων όπως είναι η α-αμυλάση, η β-αμυλάση, η γλυκοαμυλάση, η α-γλυκοσιδάση και τα ένζυμα αποπολυμερισμού διακλαδισμένου πολυμερούς (debranching enzymes). Οι ενδο-υδρολάσες, όπως είναι η α-αμυλάση, υδρολύουν τυχαία τους δεσμούς στο εσωτερικό του μορίου του πολυμερούς, γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό γραμμικών και διακλαδισμένων ολιγοσακχαριτών. Οι α-αμυλάσες συγκαταλέγονται ανάμεσα στα σημαντικότερα ένζυμα και βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή στη σύγχρονη βιοτεχνολογία. Παρόλο που αυτά τα ένζυμα παράγονται από διάφορους ζωικούς και φυτικούς ιστούς καθώς και μικροοργανισμούς, οι βακτηριακές α-αμυλάσες πληρούν συνήθως τις απαιτήσεις της βιομηχανίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η παραγωγή μιας θερμοφιλικής α-αμυλάσης από το μικροοργανισμό Bacillus subtilis, ο οποίος απομονώθηκε από νωπό πρόβειο γάλα. Συγκεκριμένα διερευνήθηκε η επίδραση διαφόρων φυσικοχημικών παραγόντων στην παραγωγή του ενζύμου από τον παραπάνω μικροοργανισμό. Οι σημαντικότεροι από τους παράγοντες αυτούς ήταν το αρχικό pH και η σύσταση του θρεπτικού μέσου, το είδος και η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα, αζώτου και φωσφόρου, η παρουσία επιφανειοδραστικών ουσιών, η συγκέντρωση του ενοφθαλμίσματος καθώς και η θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιήθηκε η καλλιέργεια. Επιπλέον για την παραγωγή της α-αμυλάσης αναπτύχθηκε ένα χαμηλού κόστους θρεπτικό μέσο, το οποίο αποτελούνταν από παραπροϊόντα της βιομηχανίας τροφίμων, όπως το εκχύλισμα του καλαμποκιού και το τυρόγαλα. Η βελτιστοποίηση της σύστασης του θρεπτικού μέσου επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τα παραπάνω παραπροϊόντα και τις σύνθετες πηγές οργανικού αζώτου, τρυπτόνη και εκχύλισμα ζύμης, σε διάφορες αναλογίες. Σε μια προσπάθεια περαιτέρω αύξησης της παραγωγής της α-αμυλάσης διερευνήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής, πέρα από τη ζύμωση βυθού, άλλων εναλλακτικών μεθόδων καλλιέργειας του βακτηρίου, όπως είναι η εκχυλιστική καλλιέργεια και η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε εκχυλιστική καλλιέργεια σε υδατικά διφασικά συστήματα αποτελούμενα από πολυαιθυλενογλυκόλη και δεξτράνη και μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των συστατικών του συστήματος στην κατανομή του ενζύμου μεταξύ των δυο φάσεων καθώς και στη συνολική του παραγωγή. Επιπλέον αναπτύχθηκε μια ημι-συνεχής διεργασία παραγωγής της α-αμυλάσης, η οποία βασίστηκε στην επαναχρησιμοποίηση των κυττάρων που περιέχονταν στην πλούσια σε δεξτράνη κατώτερη φάση καθώς και στην ανάκτηση του μεγαλύτερου μέρους της πολυαιθυλενογλυκόλης, μετά φυσικά από την εκχύλιση του ενζύμου από αυτή. Υψηλή παραγωγικότητα α-αμυλάσης διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια 12 διαδοχικών κύκλων καλλιέργειας, αυξάνοντας τη συνολική παραγωγή του ενζύμου στις 600.000 U, ενώ παράλληλα η ειδική δραστικότητα της α-αμυλάσης που παράχθηκε σε αυτή την ημι-συνεχή διεργασία εμφανίστηκε 9 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με το ομογενές σύστημα καλλιέργειας.