Βιολογικός ρόλος της απολιποπρωτεΐνης J/Clusterin στη γήρανση και στην καρκινογένεση

Abstract

Apolipoprotein J/Clusterin (CLU) is a highly conserved glycoprotein that has been implicated in many physiological intracellular and extracellular functions as well as in disturbance states including ageing and age-related diseases (i.e. cancer). Four main isoforms of the protein have been reported so far: the cytoplasmic (c-CLU), the secreted (s-CLU), the pre-nuclear (pn-CLU) and the nuclear (pn-CLU) protein. Translation of the primary CLU transcript results in the synthesis of c-CLU, which is further modified to the mature s-CLU that consists of two chains, a and β. The pnCLU is formed in the cytoplasm due to alternative splicing of the primary transcript and upon specific stimuli turns into the n-CLU isoform, translocates to the nucleus and forms a complex with the helicases Ku70/Ku86, leading to cell death. However, despite extensive efforts, the role of CLU in different situations has not been fully elucidated. Thus, the aim of this thesis is the study of the role of CLU isoforms in osteosarcoma (OS) cells response to different stress situations, including the development and maintenance of resistance of OS cells to chemotherapeutic agents. Initially, three OS cell lines (U-2 OS, Sa OS and KH OS) with different protein expression levels of CLU and p53 were exposed to the chemotherapeutic agent doxorubicin (DXR) for various periods of time. The cells that survived the treatment exhibited increased CLU mRNA and protein levels, while in dead cells, CLU accumulated in much higher amounts. The above-mentioned experiments revealed that the degree of CLU induction correlated negatively with the endogenous levels of expression of CLU and this was mainly the result of transcription regulation. Moreover, there seemed to exist a plateau of CLU intracellular level with regard to the protein’s cytoprotective ability and higher CLU levels exerted potential cytotoxic effects. Finally, it was shown that in cells with very low endogenous CLU amounts (KH OS), overproduction and secretion of s-CLU was necessary for the survival of the cells exposed to DXR. Our next goal was the assessment of the role of CLU proteins in different stress conditions in OS cells that over-expressed either the c-CLU or the pn-CLU isoform after stable transfection. Treatment of these cells with various concentrations of a diverse range of cytotoxic agents revealed that c-CLU/s-CLU function can be either antiapoptotic, neutral or proapoptotic, depending on its endogenous amount on a given cell line, the cellular context where it is expressed and the intensity of stress. When the populations of U-2 OS (high endogenous CLU levels) or Sa OS (medium endogenous CLU levels) c-CLU/s-CLU transfected cells were treated with agents causing genotoxic or oxidative stress, c-CLU/s-CLU accumulation had neutral effect or proapoptotic when the cells were exposed to a high concentration of the agent. On the contrary, when the populations of KH OS cells that overexpressed CLU after transfection were exposed to high levels of cytotoxic agents, higher survival rates were observed as compared to empty vector transfected cells (cytoprotective role of CLU). As far as the pn-CLU isoform is concerned, forced over-expression of pn-CLU in OS cells after stable transfection resulted neither in n-CLU production nor in cCLU/s-CLU up-regulation and the cells were viable. The fact that n-CLU was detected in some cell lines after specific treatments and not in the cells used in this or other studies, indicates that probably specific stimuli drive the production of pn-CLU or its conversion to n-CLU. Furthermore, pn-CLU or c-CLU/s-CLU forced overexpression in the cells used in this thesis had the same effect regarding the viability of the cells to cytotoxic agents. In order to study the potential role of CLU during the acquisition and maintenance of human cancer cells resistance to chemotherapeutic drugs, a series of DXR-resistant U-2 OS, Sa OS and KH OS cell lines were developed (DXR-R: RI, R2 and R3). Molecular characterization of the cell lines showed that DXR-resistance correlates with significant changes in the levels of various proteins. Only the R2 and R3 cells expressed increased protein levels of the multi-drug resistant marker MDR1, inhibition of which sensitized the cells to DXR. Consecutive analysis of the R2 cells revealed that they were not resistant only to DXR, but also to a variety of unrelated cytotoxic compounds. When a broad-spectrum characterization of the multi-drug resistant cell lines was complete, the expression levels of CLU were measured. The analysis uncovered a moderate (up to ~30%) up-regulation of CLU mRNA and c-CLU/s-CLU protein levels in the U-2 OS R2 cells, but a profound induction (~4-fold) in the KH OS R2 and R3 cells as compared to parental cells, similar to the pattern of expression of MDR1 and PARP proteins in these cell lines. So, a negative correlation between the endogenous CLU expression levels and the intensity of its up-regulation in the R2 and R3 cells was observed. The higher intracellular CLU levels were accompanied by increased extracellular amounts, but not altered subcellular localization. n-CLU was not detected in any cell line. Neutralization of the extracellular s-CLU protein or gene expression silencing via small interfering RNA (siRNA) rendered the KH OS R2 cells sensitive to apoptosis even without additional drug exposure. On the contrary, CLU depletion in the U-2 OS cell lines in the absence of DXR did not confer any further sensitization to the R2 cells as compared to the parental cells, apparently because the levels of CLU in the two U-2 OS cell lines are already too high. In conclusion, the results of this thesis reveal that CLU is a molecule which apart from functioning as an apolipoprotein or an efficient extracellular chaperone is also implicated in several intracellular activities. However, despite the diverse roles attributed to CLU, it could be just said, that the molecule confers a balance between cellular survival and death, according to environmental stimuli. The fact that the CLU mRNA and protein induction profile in R2 cells is similar to that of the MDR1 and PARP proteins, and that CLU gene down-regulation sensitizes the R2 cells to DXR, strongly suggest a direct implication of CLU in OS cells’ acquisition of the multi-drug resistance phenotype. Therefore, CLU could be used as a marker for chemoresistance in cancer cells.

Η Απολιποπρωτεΐνη J/Clusterin (CLU) είναι μία υψηλά συντηρημένη γλυκοπρωτεΐνη που εμπλέκεται σε πλήθος φυσιολογικών ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών λειτουργιών και παθολογικών καταστάσεων, όπως είναι η γήρανση και οι ασθένειες που τη συνοδεύουν, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Τέσσερις βασικές ισομορφές της πρωτεΐνης έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα: η κυτταροπλασματική (c-CLU), η εκκρινόμενη (s-CLU), η πρόδρομη πυρηνική (pn-CLU) και η πυρηνική (n-CLU) ισομορφή. Η μετάφραση του πρωτογενούς μεταγράψου της CLU οδηγεί στη δημιουργία της c-CLU, από την ωρίμανση της οποίας προκύπτει τελικά η s-CLU που αποτελείται από δύο πεπτιδικές αλυσίδες, την α και τη β. Εναλλακτικό μάτισμα του πρωτογενούς μεταγράφου καθοδηγεί τη δημιουργία της pn-CLU, η οποία μετατρέπεται στην n-CLU ισομορφή, μεταβαίνει στον πυρήνα όπου συνδέεται με το σύμπλεγμα των ελικασών Ku70/Ku86 και επάγει κυτταρικό θάνατο. Παρά τις εκτεταμένες όμως μελέτες για τη διαλεύκανση της δράσης της CLU, ο ρόλος της στις διάφορες καταστάσεις στις οποίες εμπλέκεται δεν έχει αποσαφηνιστεί. Σκοπός λοιπόν της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου των ισομορφών της CLU στην απόκριση οστεοσαρκωματικών (OS) κυττάρων σε διάφορες καταστάσεις στρες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης και διατήρησης ανθεκτικότητας OS κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αρχικά, τρεις OS κυτταρικές σειρές (U-2 OS, Sa OS και ΚΗ OS) με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών CLU και p53 εκτέθηκαν στο χημειοθεραπευτικό παράγοντα δοξορουβισίνη (DXR) για διάφορα χρονικά διαστήματα. Στα κύτταρα που επιβίωσαν της αγωγής με DXR παρατηρήθηκε αύξηση της CLU τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και πρωτεΐνης, ενώ στα νεκρά κύτταρα η CLU συσσωρεύτηκε σε πολύ υψηλότερα ποσά. Τα παραπάνω πειράματα έδειξαν ότι ο βαθμός επαγωγής της CLU είναι αντιστρόφως ανάλογος των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης στα κύτταρα και ρυθμίζεται κυρίως σε επίπεδο μεταγραφής. Επιπλέον, φάνηκε να υπάρχει μια μέγιστη ενδοκυτταρική ποσότητα της CLU που μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα όταν εκτίθενται σε στρες, η οποία αν ξεπεραστεί αποβαίνει τοξική γι’ αυτά. Τέλος, δείχθηκε ότι σε κύτταρα με πολύ χαμηλά ενδογενή επίπεδα της CLU (KH OS) η υπερπαραγωγή και έκκριση της s-CLU ήταν απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων που εκτέθηκαν στην DXR. Επόμενος στόχος ήταν η μελέτη του τρόπου δράσης των ισομορφών της CLU σε διαφορετικές καταστάσεις στρες σε OS κύτταρα που υπερεκφράζανε είτε τη c- CLU, είτε την pn-CLU ύστερα από μόνιμη επιμόλυνση. Οι δοκιμασίες επιβίωσης σε διάφορες συγκεντρώσεις κυτταροτοξικών ουσιών έδειξαν ότι η δράση των c-CLU/sCLU πρωτεϊνών όταν τα κύτταρα εκτεθούν σε στρες εξαρτάται από τα ενδογενή ποσά της CLU, το γενετικό υπόβαθρο των κυττάρων και την ένταση της καταπόνησης. Δηλαδή, όταν οι πληθυσμοί των U-2 OS (υψηλά ενδογενή επίπεδα της CLU) και Sa OS (μέτρια ενδογενή επίπεδα της CLU) κυττάρων που υπερεκφράζανε τις c-CLU/sCLU πρωτεΐνες μετά την επιμόλυνση εκτέθηκαν σε παράγοντες που προκαλούν γενοτοξικό ή οξειδωτικό στρες, η συσσώρευση των c-CLU/s-CLU πρωτεϊνών είτε δεν είχε καμία περαιτέρω δράση, είτε έδρασε προαποπτωτικά στα εν λόγω κύτταρα όταν χορηγήθηκε υψηλή συγκέντρωση του παράγοντα. Αντίθετα, στους πληθυσμούς των KH OS κυττάρων που υπερεκφράζανε τις c-CLU/s-CLU μετά την επιμόλυνση, παρατηρήθηκαν αυξημένα ποσοστά επιβίωσης σε συνθήκες έντονης καταπόνησης σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον άδειο φορέα έκφρασης (κυτταροπροστατευτική δράση της CLU). Όσον αφορά την pn-CLU ισομορφή, η επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο που κωδικοποιεί γι’ αυτή δεν προκάλεσε την παραγωγή της n-CLU, αλλά ούτε υπερέκφραση των c-CLU/s-CLU ισομορφών και τα κύτταρα ήταν βιώσιμα. Το γεγονός ότι η n-CLU ανιχνεύτηκε σε ορισμένες κυτταρικές σειρές που βρέθηκαν σε ένα δεδομένο περιβάλλον και όχι στα κύτταρα της εν λόγω εργασίας ή άλλων μελετών φανερώνει ότι πιθανότατα συγκεκριμένα ερεθίσματα προκαλούν την παραγωγή της pn-CLU ή τη μετατροπή της σε n-CLU. Επιπλέον, η υπερέκφραση είτε της pn-CLU είτε των c-CLU/s-CLU πρωτεϊνών στα κύτταρα της παρούσας μελέτης είχε την ίδια επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων που εκτέθηκαν σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή εμπλοκή της CLU στην εμφάνιση και διατήρηση ανθεκτικότητας ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικές ουσίες, δημιουργήθηκαν διαδοχικές γενεές U-2 OS, Sa OS και ΚΗ OS κυττάρων ανθεκτικών στην DXR (DXR-R: RI, R2 και R3). Ο μοριακός χαρακτηρισμός των κυτταρικών σειρών έδειξε ότι η εμφάνιση ανθεκτικότητας στην DXR ήταν συνυφασμένη με σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών. Μόνο τα R2 και R3 κύτταρα παρουσίασαν αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα του δείκτη πολυφαρμακευτικής ανθεκτικότητας MDR1, η αναστολή του οποίου τα ευαισθητοποίησε στην DXR. Μετέπειτα ανάλυση στις R2 σειρές έδειξε ότι η χημειοαντοχή τους δεν περιοριζόταν στην DXR, αλλά επεκτεινόταν και σε άλλους κυτταροτοξικούς παράγοντες με διαφορετικό τρόπο δράσης. Αφού ολοκληρώθηκε ο γενικός χαρακτηρισμός των σειρών, ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της CLU στα χημειοανθεκτικά κύτταρα. Η μελέτη αποκάλυψε μια μέτρια (~30%) αύξηση του mRNA της CLU και των c-CLU/s-CLU πρωτεϊνών στα U-2 OS R2 κύτταρα, αλλά μια έντονη επαγωγή (~4 φορές) στα ΚΗ OS R2 και R3 κύτταρα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πατρικά, προφίλ έκφρασης παρόμοιο με αυτό των πρωτεϊνών MDR1 και PARP στα συγκεκριμένα κύτταρα. Παρατηρήθηκε λοιπόν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ των ενδογενών επιπέδων έκφρασης της CLU και του βαθμού επαγωγής της στα R2 και R3 κύτταρα. Τα υψηλά ενδοκυτταρικά επίπεδα της CLU συνοδεύονταν και από αυξημένα εξωκυττάρια ποσά, αλλά όχι από αλλαγή στην ενδοκυττάρια κατανομή της. Η n-CLU δεν ανιχνεύτηκε σε καμία κυτταρική σειρά. Η απενεργοποίηση της εξωκυττάριας S-CLU ισομορφής της πρωτεΐνης ή η αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου της CLU με τη βοήθεια της τεχνολογίας «μικρά RNA παρεμβολής» (siRNA), ευαισθητοποίησαν σημαντικά τα ΚΗ OS R2 κύτταρα, ακόμα και χωρίς ταυτόχρονη έκθεση σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Αντίθετα, η καταστολή της έκφρασης της CLU στις U-2 OS κυτταρικές σειρές απουσία DXR δεν ευαισθητοποίησε τα R2 κύτταρα περισσότερο από τα πατρικά, γιατί τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης στις U-2 OS κυτταρικές σειρές είναι ήδη πολύ υψηλά. Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα της διατριβής φαίνεται πως η CLU είναι ένα μόριο που εκτός από το ρόλο της απολιποπρωτεΐνης ή εξωκυττάριου συνοδού μορίου εμπλέκεται και σε πλήθος ενδοκυτταρικών διαδικασιών. Όμως, παρά τη φαινομενική πολυπλοκότητα της δράσης της, θα μπορούσε απλά να ειπωθεί πως η πρωτεΐνη παρέχει μια ισορροπία μεταξύ κυτταρικής επιβίωσης και θανάτου, ανάλογα με τα ερεθίσματα που δέχεται το κύτταρο σε ένα δεδομένο περιβάλλον. Το γεγονός ότι το προφίλ της επαγωγής της CLU στα R2 κύτταρα ήταν παρόμοιο με αυτό των πρωτεϊνών MDR1 και PARP καθώς και το γεγονός ότι η καταστολή της έκφρασης της CLU ευαισθητοποίησε τα R2 κύτταρα στην DXR αποτελούν ισχυρές ενδείξεις ότι η CLU εμπλέκεται άμεσα στην απόκτηση του χημειοανθεκτικού φαινοτύπου στα OS κύτταρα και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης χημειοανθεκτικότητας σε καρκινικά κύτταρα.