Μελέτη της επιβιωτικής λειτουργίας της Απολιποπρωτεΐνης J (CLU) στην κυτταρική γήρανση καθώς και κατόπιν επίδρασης εξωγενών κυτταροτοξικών περιβαλλοντικών ερεθισμάτων

Abstract

CLU is a survival factor that has been implicated in many physiological intracellular and extracellular functions as well as in disturbance states including ageing. Since CLU is up-regulated following treatment with a wide variety of cytotoxic agents, such as heat shock, oxidative stress, chemotherapy, ultraviolet and ionizing radiation, the aim of this thesis was to assess the effect of proteasome and lysosome inhibition on CLU expression and to determine whether CLU constitutes a proteolytic substrate of the proteasome or the lysosome. Complete as well as partial inhibition of the proteasome resulted in increased CLU mRNA and protein expression levels of both intracellular CLU isoforms, psCLU and sCLU, in primary cultures of young and old fibroblasts WI38 and human osteosarcoma U-2 OS cells. Since transcriptional elements of HSF-1 and AP-1 can be found on CLU promoter, we then proceeded to the investigation of the transcription factor responsible for CLU gene induction upon proteasome inhibition. By the use of two specific inhibitors against HSF-1 and AP-1, we concluded that HSF-1 is involved in CLU up-regulation following proteasome inhibition. As far as the proteasomal degradation of CLU protein is concerned, pulse-chase experiments in the presence or not of proteasome inhibitors, revealed accumulation of both CLU isoforms intracellularly following proteasome inhibition, whereas no effect on the secretion rate was observed, suggesting that CLU is degraded by the proteasome. In order to investigate whether CLU is modified by ubiquitination, cycloheximide chase analysis in the presence or not of a specific E1-ligase inhibitor was performed. The results indicated that both CLU isoforms are ubiquitinated. The same picture was drawn by immunoprecipitation experiments of CLU and ubiquitin protein or after sequential immunoprecipitation of CLU and ubiquitin proteins, which revealed a number of higher molecular weight bands that probably represent ubiquitinated forms of CLU. Moreover, immunoprecipitation experiments with a Hrd1/Synoviolin antibody co-precipitated both CLU isoforms, suggesting that CLU is ubiquitinated by the endoplasmic reticulum E3-ligase Hrd1/Synoviolin under stress and normal conditions. The next goal of the thesis was the investigation of the effect of lysosome inhibition on CLU expression levels. Lysosome inhibition led to elevated protein levels of CLU isoforms, but not mRNA levels, in HFL-1 primary fibroblasts and U-2 OS cells. Cycloheximide chase analysis of CLU protein in the presence or not of lysosome inhibitors revealed that both psCLU and sCLU accumulated following lysosome inhibition, suggesting that both isoforms are degraded at the lysosome. The secretion of the protein was not found altered upon lysosomal inhibition. We then examined the fate of sCLU after its internalization. Therefore, an excess of a CLU antibody was added to the U-2 OS cell culture supernatant in order to prevent sCLU internalization in the presence of a lysosomal inhibitor. Addition of the antibody to the cell culture supernatant resulted in reduced intracellular sCLU protein levels, with the effect being further enhanced in the presence of the lysosome inhibitor, suggesting that sCLU is endocytosed and targeted for degradation at the lysosome. Addition of the megalin receptor antagonist RAP to the U-2 OS cell culture supernatant in the presence of a lysosomal inhibitor, gave similar results, thus verifying that secreted CLU is internalized by megalin receptor and sorted to the lysosome. Moreover, transfer of L-[S35]-methionine-labelled medium containing labelled sCLU into a flask of U-2OS cells in the presence or not of a lysosome or proteasome inhibitor, revealed that sCLU is endocytosed 1 h later, as judged by the detection of radiolabelled sCLU in the cells. Chloroquine addition led to further accumulation of the internalized CLU, while use of a proteasome inhibitor did not affect this process, indicating that sCLU is recycled from the cell culture supernatant via endocytosis followed by degradation within the lysosome lumen.

Η CLU αποτελεί έναν επιβιωτικό παράγοντα, ο οποίος εμπλέκεται σε μια πληθώρα φυσιολογικών διεργασιών και υπερ-εκφράζεται τόσο στην κυτταρική γήρανση όσο και κατόπιν επίδρασης εξωγενών κυτταροτοξικών περιβαλλοντικών ερεθισμάτων, όπως θερμικό σοκ, οξειδωτικό στρες, επίδραση με υπέρυθρη ή ιονίζουσα ακτινοβολία και με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Έτσι θεωρήθηκε σκόπιμο στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής να μελετηθεί η επίδραση του πρωτεασωμικού και λυσοσωμικού στρες στην έκφραση της CLU, αλλά και ο καθορισμός αν η CLU αποτελεί πρωτεολυτικό υπόστρωμα του πρωτεασώματος ή του λυσοσώματος. Ολική καθώς και μερική αναστολή του πρωτεασώματος είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επίπεδων mRNA και πρωτεΐνης της CLU σε πρωτογενείς κυτταροκαλλιέργειες νεαρών και γερασμένων ινοβλαστών WI38, αλλά και κύτταρα οστεοσαρκώματος U-2 OS. Επιδρώντας στη συνέχεια με δυο ειδικούς αναστολείς των μεταγραφικών παραγόντων HSF-1 και AP-1, οι οποίοι έχουν στοιχεία πρόσδεσης στον υποκινητή της CLU, παρατηρήθηκε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας HSF-1 είναι υπεύθυνος για την επαγωγή του mRNA της CLU όταν ανασταλεί το πρωτεάσωμα. Όσο αφορά την πιθανή αποικοδόμηση της CLU από το πρωτεάσωμα, πειράματα επώασης με ραδιενεργή μεθειονίνη και ώσης για μερικές ώρες παρουσία ή μη αναστολέα του πρωτεασώματος σε κύτταρα U2-OS, απέδειξαν ότι και οι δυο ενδοκυτταρικές μορφές της CLU, οι psCLU και sCLU, συσσωρεύονται όταν ανασταλεί το πρωτεάσωμα, ενώ η έκκριση δεν επηρεάζεται, πράγμα που σημαίνει ότι και οι δυο αυτές ισομορφές αποικοδομούνται από το πρωτεάσωμα. Επίσης, πειράματα μελέτης της κινητικής της CLU για μερικές ώρες μετά την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης με κυκλοεξιμίδιο και παρουσία ή μη ενός ειδικού αναστολέα της Ε1 λιγάσης σε κύτταρα U2-OS, απέδειξαν ότι και οι δυο ενδοκυτταρικές μορφές της CLU συσσωρεύονται όταν ανασταλεί η Ε1 λιγάση, δηλαδή ουμπικουϊτυλιώνονται. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της CLU ή ουμπικουΐτίνης, καθώς και πειράματα διαδοχικής ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι της CLU και στη συνέχεια έναντι της ουμπικουΐτίνης, ανίχνευσαν μορφές υψηλότερου μοριακού βάρους από αυτό της CLU, οι οποίες ενδέχεται να απεικονίζουν ουμπικουϊτιλιωμένες μορφές της CLU. Τέλος, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της λιγάσης του ενδοπλασματικού δικτύου Hrd1/Synoviolin, έδειξαν ότι η CLU ουμπικουϊτυλιώνεται από την λιγάση αυτή τόσο υπό κανονικές συνθήκες όσο και κατόπιν στρες. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η έκφραση της CLU όταν ανασταλεί το δεύτερο ενδοκυτταρικό μονοπάτι αποικοδόμησης, εξωκυττάριων κυρίως πρωτεϊνών, το λυσόσωμα. Αναστολή του λυσοσώματος σε U-2 OS και WI38 κύτταρα, οδήγησε σε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων της CLU, αφήνοντας αναλλοίωτα τα επίπεδα mRNA, πιθανώς εξαιτίας της μειωμένης αποικοδόμησής της από το λυσόσωμα. Για να διερευνηθεί περεταίρω η πιθανή αποικοδόμηση της CLU από το λυσόσωμα, πειράματα μελέτης της κινητικής της CLU για μερικές ώρες μετά την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης με κυκλοεξιμίδιο και παρουσία ή μη αναστολέα του λυσοσώματος σε κύτταρα U2-OS, απέδειξαν ότι και οι δυο ενδοκυτταρικές μορφές της CLU συσσωρεύονται έπειτα από αναστολή του λυσοσώματος, άρα αποικοδομούνται από το λυσόσωμα.