Ανοσοϊστοχημική μελέτη του σηματοδοτικού συστήματος Notch ( Notch signaling) σε περιακρορριζικές κύστεις

Abstract

Introduction Apical periodontitis is a chronic inflammatory disorder of periradicular tissues caused by persistent microbial infection within the root canal system of the affected tooth. The mechanisms underlying development and expansion of periapical cysts have not been fully elucidated. It is thought that the epithelial cell rests of Malassez proliferate under the influence of mediators and growth factors released by various cells residing in the periapical tissues, forming an epithelium-lined cavity. Regarding cyst expansion, nowadays research has been focused on the molecular mechanisms of epithelial cell proliferation. It is widely accepted that Notch signaling controls cell fate decisions and proliferation during development and tumorigenesis of a wide range of tissues and organs. In mammals, four Notch receptors (Notch 1- Notch 4) and five structurally similar Notch ligands (Delta 1, Delta 3, Delta 4, Jagged 1 and Jagged 2) have been identified. It is a single-pass transmembrane protein consisting of a large extracellular domain, involved in ligand binding and a cytoplasmic domain involved in signal transduction. The Notch ligands are also single-pass membrane-bound proteins. Notch-ligand interactions result in the proteolytic cleavage of the extracellular region of Notch and in the subsequent cleavage within the transmembrane region of the receptor. Proteolysis results in the release of the Notch intracellular domain (NICD), which translocates to the nucleus, where it binds to the transcription factor CSL. The NICD/CSL interaction converts CSL from a transcriptional repressor into a transcriptional activator by displacing the corepressor (Co-R) complex. The most well-defined targets of the NICD-CSL complex are the HES family of basic helix-loop-helix transcription factors. Recent work suggests that Notch receptors and ligands are expressed in epithelial-mesenchymal interactions during odontogenesis, and are associated with dental pulp pathology after injury, carious lesions or pulp capping. They, also, regulate oral epithelia during palate development to prevent premature palatal shelf adhesion to other oral tissues and to facilitate normal adhesion between the elevated palatal shelves. To date, there is no published study on Notch expression in periapical cysts or any other jaw cyst. In the present study the expression of Notch 1 and Notch 2 receptors, the ligand Delta 1 and the transcription factors HES 1 and HES 5 in the epithelial cells of periapical cysts was evaluated. Material and Methods Fifty five periapical cysts from 55 patients retrieved from archival material of the files (1990-1995) of the Department of Oral Pathology and Medicine, Dental School, National and Kapodestrian University of Athens were used in this study. All lesions were fixed in 10% neutral buffered formalin solution (24-48h), dehydrated by graded alcohol, embedded in paraffin wax and prepared for immunohistochemistry. Diagnosis was established on conventional haematoxylin and eosin stained tissue sections. All lesions showed a well-defined cystic sac lined by non-keratinized squamous epithelium, with minimum inflammation in the underlying connective tissue. Immunohistochemistry was performed with the following antibodies: Rat Anti-Human Notch 1 Monoclonal Antibody (catalog No: bTAN 20, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa, USA), Rat Anti-Human Notch 2 Monoclonal antibody (catalog No: c651.6dbhn, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa, USA), Rabbit anti-Mouse DELTA-1 antibody (catalog No: 600-401-858, Rockland Immunochemicals, USA), anti-rat HES 1 monoclononal antibody, catalogue No: D134-3, MBL, Int. Inc., Woburn, MA, USA), rabbit anti-HES 5 polyclononal antibody (catalogue no: AB/HLH54, CeMines, Inc., Biosystems Division, Golden Colorado, USA). In particular 5 μm-thick sections were deparaffinized in xylene, rehydrated with graded ethanols, boiled in 10mM citrate buffer, pH 6.0, for 10 - 20 min for antigen retrieval, cooled at room temperature for 20 min and stained with DAB (diaminovenzidin) that gives a brown colour and Fast Red that gives intense red colour. Breast and lung tumours were served as positive controls. ...........................................................................................

Σκοπός Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της συμμετοχής του σηματοδοτικού συστήματος Notch στους μηχανισμούς ανάπτυξης των περιακρορριζικών κύστεων, μέσω της ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης του συνδέσμου Delta 1, των υποδοχέων Notch 1 και Notch 2 και των μεταγραφικών παραγόντων HES 1 και HES 5 του καταρράχτη του σηματοδοτικού συστήματος Notch στο επιθήλιο των περιακρορριζικών κύστεων. Μεθοδολογία Ανοσοϊστοχημεία Αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσαν περιακρορριζικές κύστεις, οι οποίες αφαιρέθηκαν χειρουργικά, κατά την χρονική περίοδο 1990-1995, μετά από ακρορριζεκτομή δοντιών με αποτυχημένη ενδοδοντική θεραπεία. Τα ιστοτεμάχια της μελέτης είχαν εξετασθεί ιστοπαθολογικά στο Εργαστήριο της Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών. Από το σύνολο των 4121 ιστοτεμαχίων, επιλέχθηκαν 55 παρασκευάσματα που αντιστοιχούσαν σε 55 ασθενείς. Τα ιστοτεμάχια που επιλέχθηκαν εμφάνιζαν αντιπροσωπευτική ιστολογική εικόνα περιακρορριζικής κύστης, σύμφωνα με τα καθιερωμένα ιστολογικά κριτήρια (παθολογική κοιλότητα που επενδύεται από επιθήλιο) και με ελάχιστη έως ήπια φλεγμονώδη διήθηση (μικρός αριθμός φλεγμονωδών κυττάρων ανά οπτικό πεδίο). Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τομές καρκίνου του μαστού και καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου, στους οποίους έχει βρεθεί ερευνητικά ότι εκφράζουν τον υποδοχέα Notch. Ως αρνητικός μάρτυρας και για τα πέντε αντισώματα χρησιμοποιήθηκε υποκατάστατο του αρχικού κάθε φορά αντισώματος με ανοσοορό του ίδιου είδους ζώου. Επιλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: Υποδοχέας Notch 1: rat anti-human Notch 1 monoclonal antibody, catalog No: bTAN 20, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa, USA. Υποδοχέας Notch 2: Rat Anti-Human Notch 2 Monoclonal antibody, catalog No: c651.6dbhn, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa, USA. Σύνδεσμος Delta 1: rabbit anti-Mouse DELTA-1 antibody, catalog No: 600-401-858, Rockland Immunochemicals, USA. Μεταγραφικός παράγοντας HES 1: anti-rat HES 1 monoclononal antibody, catalog No: D134-3, MBL, Int. Inc., Woburn, MA, USA. Μεταγραφικός παράγοντας HES 5: rabbit anti-HES 5 polyclononal antibody, catalog no: AB/HLH54, CeMines, Inc., Biosystems Division, Golden Colorado, USA. Στη συνέχεια ακολούθησε η ανοσοϊστοχημική χρώση των τομών παραφίνης. Μετά από παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο καταγράφηκε η συγκεκριμένη θέση εντόπισης των αντισωμάτων στις ιστολογικές τομές. Στη συνέχεια η κάθε ιστολογική τομή φωτογραφήθηκε και αρχειοθετήθηκε σε ηλεκτρονική μορφή. Η ένταση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης (staining intensity) κάθε οπτικού πεδίου υπολογίσθηκε με την εφαρμογή Ημιαυτόματου Συστήματος Ανάλυσης Εικόνας (Semi automated Ιmage Analysis System) - (Hardware: Mobile Intel Pentium Dual core/ Digital Still Camera SONY CyberShot DSC-P73 (1024X768), Μικροσκόπιο Olympus CX-31. Software (Λογισμικό): Windows XP/Image Pro Plus version 5.1-Media Cybernetics 2000). Το εύρος της έντασης στο συγκεκριμένο σύστημα αντιστοιχεί σε επίπεδα συνεχών τιμών από 0 (απόλυτο μαύρο) έως 255 (απόλυτο λευκό) (μειούμενες τιμές = βαθυχρωματικότητα). Τα περιστατικά κατηγοριοποιήθηκαν ως εξής: ασθενής ένταση χρώσης: τιμές χρώσης ? 151, μέτρια ένταση χρώσης: τιμές χρώσης 121-150, ισχυρή ένταση χρώσης: τιμές χρώσης ?120. ..............................................