Η χρήση της μεταβολονομικής στη διερεύνηση των νεφρικών παθήσεων

Abstract

High resolution proton Nuclear Magnetic Resonance (¹H-NMR) spectroscopy of urine is a non-invasive analytical technique, which provides an overall profile of the low molecular weight metabolites excreted in urine that alters characteristically in response to changes in physiological status, toxic insult, or disease processes. This ¹H-NMR-based urinary metabolic profile can be characterized as a multivariate dataset. The exploitation of the NMR-generated metabolic datasets can be increased by the application of multivariate statistical data analysis methods, such as pattern recognition techniques, that allow sample classification and effective interpretation. This relatively new approach, known as Metabonomics, has had major applications in clinical and biomedical topics, such as drug toxicity assessment, identification of biomarkers of toxicity and disease, and the understanding of the mechanisms of metabolic responses. In the current thesis, a ¹H NMR-based metabonomic approach is used for the first time to investigate the urinary metabolite profile of a healthy Greek population and that of renal patients with glomerulonephritis, who were histopathologically diagnosed with tubulointerstitial lesions of mild, moderate and severe extent. Initially, a multivariate data analysis methodology is developed and various techniques concerning sample preparation, spectra acquisition and data processing are evaluated. The metabolite profile of the healthy subjects is examined in relation to gender and age, and reference intervals of the major metabolites detected in urine spectra are determined. The main aim of this prospective study is to investigate the correlation of tubulointerstitial lesions found in renal biopsies, with the metabolite profile of urine analyzed by ¹H-NMR-based metabonomics in patients with glomerulonephritis. In particular, the pattern recognition techniques used, are Principal Components Analysis (PCA), Partial Least Squares-Discriminant Analysis (PLS-DA) and the data filtering technique of Orthogonal Signal Correction (OSC). The first step of pattern recognition analysis concerned the investigation of the urinary metabolic profile of 122 healthy Greeks. For the differentiation between gender-based and age-based groups, ‘supervised’ and ‘unsupervised’ pattern recognition techniques were used. The multivariate data analysis led to the construction of two robust models that were able to predict the class membership of the subjects according to their gender and age. The application of PCA to the metabonomic set provided a general overview of the spectral data and resulted in a slight separation trend between men and women and between subjects aged below 35 and above 50 years old. Through PLS-DA, a more evident differentiation between the groups studied was detected, still containing, however, considerable overlap between the two classes. The application of OSC eliminated the intersubject variation and enabled a clear separation in the OSC-filtered models. The final OSC/PLS-DA models were tested by means of internal validation procedures and were proven able to correctly predict the corresponding gender and age (below 35 and above 50yo) in a confidence region > 95%. The overall metabonomic analysis indicated that men tended to excrete higher levels of creatinine, trimethylamine-M-oxide (TMAO), taurine and to a lesser extent 3-hydroxybyturate than women, whereas women excreted higher levels of citrate, creatine and glycine and to a lesser extent phenylalanine than men. Similarly, subjects > 50yo presented higher urinary concentrations of TMAO and citrate and lower urinary concentrations of creatinine and hippurate than subjects < 35yo. The main low molecular weight metabolites detected in the ¹H-NMR urine spectra were quantified and reference values with the corresponding confidence intervals for men, women and subjects below and above 45yo were determined for the first time in the Greek population. Secondly, an 'H NMR-based metabonomic urinalysis of 77 patients with glomerulonephritis was correlated with the severity of the renal damage on the basis of histopathologically assessed tubulointerstitial lesions. The urinary metabolite profiles of these patients at any disease stage (mild, moderate, severe renal damage) showed distinct alterations from those recorded from 85 age- and sex- matched healthy individuals. These alterations were more obvious in patients with severe renal disease and reflected the extent of the damage in the proximal tubules and/or the tubulointerstitial tissue, as it was classified by the histopathological diagnosis. It was shown that the onset of the tubulointerstitial lesions is characterized by decreased excretion of citrate, hippurate, glycine, and creatinine, whereas further deterioration is followed by total depletion of citrate and hippurate, decreased excretion of glycine, glycosuria, selective aminoaciduria (increased excretion of alanine, histidine and phenylalanine), and a gradual increase in the excretion of lactate, acetate, and TMAO. The application of pattern recognition methods allowed the extraction of the most discriminate information from the multivariate NMR data and an effective sample classification, not only between healthy individuals and patients with glomerulonephritis, but also among the patients’ subgroups. The initial PCA was important for the detection of outlying spectra, in order to assess a consistent metabonomic approach and showed a separation trend between patients and healthy individuals. Through PLS-DA, a strong separation trend between these two groups was detected. The application of OSC-filtering led to the elimination of the intersubject variation and enabled a clear and statistically significant separation in the resulting models. These models were able to predict the presence of renal damage with a sensitivity of 96% and a specificity of 99%, based on a 95% confidence limit for class membership. Patients with mild, moderate and severe tubulointerstitial lesions were progressively differentiated from the healthy individuals. A further comparison of the patients’ subgroups revealed a statistically significant separation between patients with mild lesions and those with severe, and a high predictive ability of the corresponding OSC/PLS-DA models. Concerning the comparison between moderate and mild and between moderate and severe renal damage subgroups, the separation was nonsignificant, but quite evident in the OSC/PLS-DA models. In conclusion, since the coexistence of tubular and interstitial lesions in glomerulonephritis is of crucial prognostic importance for the progress of renal glomerular function, NMR-based metabonomic urinalysis, as a rapid and non-invasive analytical technique, could contribute to the early evaluation of the severity of renal damage and possibly to the monitoring of kidney function. The published results of the present thesis are hopefully expected to be included in the ongoing effort to accomplish a complete mapping of the metabolite profiles of various biofluids in man. This effort has been developed by the research protocol, called the Human Metabolome Project (http://www.metabolomics.ca/index.htm) with the aim to identify and quantify all detectable metabolites (> 1μΜ) in the human body. The present study also reinforces the “urgent need”, addressed in 2004 by the American Society of Nephrology, to develop among other bioresearch approaches, a metabolomic-based infrastructure for kidney research, especially as a means of a biomarker search strategy in diabetic nephropathy.

Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (¹Η-NMR) των ούρων είναι μία μη επεμβατική τεχνική με την οποία καταγράφεται το σύνολο των απεκκρινόμενων μεταβολιτών μικρού μοριακού βάρους σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Η τεχνική αυτή προσφέρει δηλαδή μια αποτύπωση του μεταβολικού προφίλ των ούρων, το οποίο αποτελεί ένα σύνολο πολυμεταβλητών δεδομένων (multivariate dataset). Η ανάλυση των δεδομένων αυτών μπορεί να βελτιστοποιηθεί με τη χρήση κατάλληλων τεχνικών στατιστικής επεξεργασίας δεδομένων, όπως είναι οι τεχνικές αναγνώρισης προτύπων (pattern recognition). Η ανάλυση αυτή εντάσσεται στα πλαίσια της Μεταβονομικής (Metabonomics), η οποία είναι ένα σύστημα στατιστικής επεξεργασίας του συνολικού προφίλ των μεταβολιτών που ανιχνεύονται στα βιολογικά υγρά και το οποίο αντανακλά τόσο φυσιολογικές καταστάσεις, όσο και την απόκριση του οργανισμού σε παθολογικές οντότητες ή τοξικές επιδράσεις. Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιείται για πρώτη φορά με βάση τη φασματοσκοπία ¹H-NMR μια μεταβονομική προσέγγιση ανάλυσης του μεταβολικού προφίλ των ούρων, αφενός ενός υγιούς ελληνικού πληθυσμού και αφετέρου ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, οι οποίοι παρουσίαζαν ιστοπαθολογικά τεκμηριωμένες αλλοιώσεις του σωληναριοδιάμεσου ιστού ήπιου, μέτριου και σοβαρού βαθμού. Αρχικά προτείνεται και αναπτύσσεται μια μεθοδολογία για την ανάλυση των πολυμεταβλητών δεδομένων NMR και αξιολογούνται διάφορες τεχνικές όσον αφορά την προετοιμασία των δειγμάτων, τη λήψη των φασμάτων και την επεξεργασία των δεδομένων. Στη συνέχεια, διερευνάται η επίδραση του φύλου και της ηλικίας των υγιών ατόμων στο μεταβολικό προφίλ των ούρων και παράλληλα προσδιορίζονται οι τιμές αναφοράς των κυριότερων απεκκρινόμενων μεταβολιτών. Ο κύριος στόχος όμως της εργασίας είναι η συσχέτιση των ιστοπαθολογικά τεκμηριωμένων αλλοιώσεων του σωληναριοδιάμεσου ιστού με το μεταβολικό προφίλ των ούρων ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, βάσει της ¹Η-NMR μεταβονομικής. Συγκεκριμένα, εφαρμόζονται οι τεχνικές Principal Components Analysis (PCA), Partial Least-Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) και Orthogonal Signal Correction (OSC). Το πρώτο στάδιο της εφαρμογής των τεχνικών αναγνώρισης προτύπων αφορούσε τη μελέτη του συνολικού μεταβολικού προφίλ των ούρων ενός δείγματος 122 υγιών ατόμων, από την οποία προέκυψαν δυο στατιστικά μοντέλα ικανά να προβλέψουν ορθά το φύλο και την ηλικία αυτών. Αρχικά μέσω της τεχνικής PCA, έγινε μια γενική επισκόπηση των πολυμεταβλητών δεδομένων, με σκοπό την δημιουργία ενός συγκροτημένου συνόλου δειγμάτων και την αξιολόγηση της ομοιογένειας του πληθυσμού. Η ανάλυση με την τεχνική αυτή έδειξε μία αδρή τάση διαχωρισμού μεταξύ ανδρών και γυναικών και μεταξύ ατόμων ηλικίας κάτω των 35 ετών και άνω των 50 ετών. Η ανάλυση PLS-DA επέφερε έναν πιο ευδιάκριτο διαχωρισμό με σημαντικό βαθμό όμως αλληλοεπικάλυψης, ενώ η αποτελεσματική ελαχιστοποίηση της διατομικής μεταβλητότητας με την εφαρμογή της τεχνικής OSC, κατέδειξε μια σαφή διάκριση μεταξύ των ομάδων φύλου και ηλικίας. Με τον συνδυασμό των τεχνικών OSC και PLS-DA πρόεκυψαν στατιστικά μοντέλα που μπόρεσαν να προβλέψουν με απόλυτη επιτυχία, μέσω διαδικασιών εσωτερικής αξιολόγησης, το φύλο και την ηλικία (> 50 και < 35 ετών) για επίπεδο εμπιστοσύνης > 95%. Παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα της κρεατινίνης, του τριμεθυλο-Ν-αμινοξειδίου (ΤΜΑΟ), της ταυρίνης και σε μικρότερο βαθμό του 3-υδροξυβουτυρικού οξέος εντοπίστηκαν σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα στους άνδρες, ενώ τα επίπεδα του κιτρικού οξέος, της κρεατίνης, της γλυκίνης και σε μικρότερο βαθμό της φαινυλαλανίνης εντοπίστηκαν σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα στις γυναίκες. Αντίστοιχα φάνηκε ότι τα επίπεδα απέκκρισης του ΤΜΑΟ και του κιτρικού οξέος ήταν υψηλότερα στα άτομα ηλικίας > 50 ετών, ενώ τα επίπεδα της κρεατινίνης και του ιππουρικού οξέος ήταν χαμηλότερα στα άτομα ηλικίας < 35 ετών. Έγινε επίσης ποσοτικοποίηση των κυριοτέρων απεκκρινόμενων μεταβολιτών που ανιχνεύονται με την ¹Η-NMR φασματοσκοπία και για πρώτη φορά στον ελληνικό πληθυσμό προσδιορίστηκαν τιμές αναφοράς και διαστήματα εμπιστοσύνης για τα δυο φύλα καθώς και για άτομα ηλικίας > και ≤ 45 ετών. Σε δεύτερο στάδιο, η ¹Η-NMR μεταβονομική ανάλυση των ούρων 77 ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα συσχετίσθηκε με τη σοβαρότητα της νεφρικής βλάβης, όσον αφορά τις αλλοιώσεις του σωληναριοδιάμεσου ιστού βάσει των ιστοπαθολογικών ευρημάτων. Τα μεταβολικά προφίλ των ούρων των ασθενών παρουσίασαν σε κάθε ένα από τα τρία στάδια της νόσου (ήπια, μέτρια και σοβαρή νεφρική βλάβη) σαφείς διαφορές από τα αντίστοιχα προφίλ των υγιών. Οι αλλοιώσεις αυτές ήταν πιο εμφανείς στην ομάδα των ασθενών με σοβαρή νεφρική νόσο, αντανακλώντας την έκταση της βλάβης στα εγγύς σωληνάρια ή/και στο σωληναριοδιάμεσο ιστό, βάσει της κατάταξης που καθόρισε η ιστοπαθολογική διάγνωση. Παρατηρήθηκε ότι το αρχικό στάδιο των σωληναριοδιάμεσων αλλοιώσεων χαρακτηρίζεται από μειωμένη απέκκριση κιτρικού και ιππουρικού οξέος, γλυκίνης και κρεατινίνης. Περαιτέρω επιδείνωση οδηγεί σε πλήρη αναστολή της απέκκρισης κιτρικού και ιππουρικού οξέος, σε μειωμένη απέκκριση γλυκίνης, σε γλυκοζουρία και επιλεκτική αμινοξουρία (αυξημένη απέκκριση αλανίνης, ιστιδίνης και φαινυλαλανίνης), καθώς και σε σταδιακή αύξηση της απέκκρισης γαλακτικού και οξικού οξέος καθώς και ΤΜΑΟ. Η εφαρμογή των τεχνικών αναγνώρισης προτύπων επέτρεψε μια σαφή διαφοροποίηση όχι μόνο μεταξύ των ομάδων υγιών και ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, αλλά και μεταξύ των επιμέρους υποομάδων των ασθενών. Η τεχνική PCA ανέδειξε μια αδρή τάση διαφοροποίησης, ενώ η τεχνική PLS-DA μια ισχυρή τάση διαχωρισμού μεταξύ των δυο ομάδων. Η ελαχιστοποίηση της διατομικής μεταβλητότητας μέσω της εφαρμογής της τεχνικής OSC, συνετέλεσε στη δημιουργία στατιστικών μοντέλων που έδειξαν έναν σαφή και στατιστικά σημαντικό διαχωρισμό μεταξύ υγιών και ασθενών. Τα στατιστικά αυτά μοντέλα ήταν σε θέση να προβλέψουν την παρουσία νεφρικής βλάβης με ευαισθησία 96% και ειδικότητα 99% για επίπεδο εμπιστοσύνης > 95%. Οι ασθενείς με αλλοιώσεις ήπιου, μέτριου και σοβαρού βαθμού διαφοροποιήθηκαν σταδιακά από τα υγιή άτομα. Με την περεταίρω σύγκριση μεταξύ των επιμέρους υποομάδων των ασθενών, πρόεκυψαν μοντέλα OSC/PLS- DA που έδειξαν στατιστικά σημαντικό διαχωρισμό μεταξύ αυτών με ήπια και σοβαρή νεφρική βλάβη, καθώς και μια υψηλή ικανότητα πρόβλεψης της σοβαρότητας της νόσου. Κατά τη σύγκριση μεταξύ των υποομάδων μέτριας - ήπιας και μέτριας - σοβαρής βλάβης, ο διαχωρισμός ήταν εμφανής αλλά όχι στατιστικά σημαντικός. Η συνύπαρξη σωληναριοδιάμεσων αλλοιώσεων στη σπειραματονεφρίτιδα παίζει καθοριστικό προγνωστικό ρόλο στην εξέλιξη της σπειραματικής νεφρικής νόσου. Στα κρίσιμο αυτό σημείο, φαίνεται ότι η μεταβονομική ανάλυση της σύστασης των ούρων βάσει της φασματοσκοπίας NMR, ως μια γρήγορη και μη επεμβατική αναλυτική τεχνική, μπορεί να συμβάλει αφενός μεν στην έγκαιρη εκτίμηση της σοβαρότητας της νεφρικής βλάβης, αφετέρου δε στην παρακολούθηση της νεφρικής λειτουργίας. Τα αποτελέσματα της μεταβονομικής μελέτης τόσο των υγιών όσο και των ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα, μπορούν να συμβάλουν στην προσπάθεια που καταβάλλεται για την πλήρη καταγραφή του μεταβολικού προφίλ των βιολογικών υγρών του ανθρώπου στα πλαίσια του Human Metabolome Project (http://www.metabolomics.ca/index.htm). Το ερευνητικό αυτό πρωτόκολλο έχει ως στόχο την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση όλων των ανιχνεύσιμων μεταβολιτών (> 1μΜ) του ανθρωπίνου οργανισμού και έχει οδηγήσει στην δημιουργία της πληρέστερης αυτή τη στιγμή τράπεζας μεταβολομικών δεδομένων στον κόσμο. Η παρούσα εργασία υπογραμμίζει επίσης την «επιτακτική ανάγκη» που εξέφρασε η Αμερικανική Εταιρεία Νεφρολογίας το 2004 για την ενσωμάτωση της μεταβολομικής στην έρευνα των νεφρικών παθήσεων, ιδιαίτερα στη στρατηγική αναζήτησης βιολογικών δεικτών για την διαβητική νεφροπάθεια (American Society of Nephrology, 2005).