Ραδιοχημική μελέτη και ραδιοφαρμακολογική αξιολόγηση επισημασμένων πεπτιδικών παραγώγων

Abstract

It has been shown that gastrin releasing peptide receptors (GRP-Rs) are overexpressed in various types of cancer cells. Bombesin is an analogue of the mammalian GRP that binds with high specificity and affinity to GRP-Rs. Significant research efforts have been lately devoted to the design of radiolabeled 8 or 14 aminoacid bombesin (BN) peptides for the detection (with gamma or positron emitting radionuclides) and therapy (with β-emitting radionuclides) of cancer. The specific aim of the present study was to investigate further the radiolabeled peptide structure and to determine whether the total absence of a linker or the use of a diverse aminoacid sequence could influence the biodistribution profile of the new compounds for specific targeting of prostate cancer. Thus, two new derivatives with the structure Gly-Gly-Cys-X-BN[2-14], where linker X, is either zero ΒΝ(I) or Orn-Orn-Orn (Orn:Ornithine) ΒΝ(II) were designed and synthesized. The corresponding 99mTc-BN(I) and 99mTc-BN(II) derivatives were obtained with high radiochemical yield (>98%) and had almost identical retention times in RP-HPLC with the 185/187Re complexes, which were also characterized by ESI-MS. Metabolic stability was found high in human plasma, moderate in PC-3 cells and rather low in mouse liver and kidney homogenates for both BN derivatives studied. BN (I) was less stable than BN(II) in cell culture and liver homogenates. A satisfactory binding affinity to GRP-Rs, in the nanomolar range, was obtained for both BN derivatives, as well as for their Rhenium complexes, with BN (II) demonstrating the highest one. In vitro internalisation/externalisation assays indicated that ~6% of 99mTc-BN (I) and ~25% of 99mTc-BN (II) were internalized into PC-3 cells. In vivo evaluation in normal Swiss mice and in tumor bearing SCID mice showed that 99mTc-BN(II) presented tumor and pancreas uptake higher than 99mTc-BN(I). Small animal SPECT dynamic imaging, carried out after injection of 99mTc-ΒΝ(Ι) and 99mTc-BN(II) in mice bearing PC-3 tumors, resulted to PC-3 tumor delineation with low background activity especially for 99mTc-BN(II). Overall, this study performed for two new N3S-X-BN[2-14] derivatives indicated that hydrophilicity and charge affected strongly the in vitro and in vivo binding properties as well as the biodistribution pattern.

Έχει αποδειχθεί υπερέκφραση πεπτιδικών υποδοχέων απελευθέρωσης γαστρίνης (GRP-Rs) σε διαφόρους τύπους καρκίνου. Η Μπομπεσίνη, ένα δεκατετραπεπτίδιο ανάλογο των πεπτιδίων απελευθέρωσης γαστρίνης (GRP), έχει απομονωθεί στα θηλαστικά και εμφανίζει υψηλή συγγένεια δέσμευσης και ειδικότητα με τους υποδοχείς απελευθέρωσης γαστρίνης (GRP-Rs). Πρόσφατα, σημαντικό ερευνητικό ενδιαφέρον έχει επιδειχθεί διεθνώς όσον αφορά στο σχεδιασμό αναλόγων Μπομπεσίνης (BN) 8 ή 14 αμινοξικών καταλοίπων επισημασμένων είτε με ραδιοϊσότοπα που εκπέμπουν γ και β+ σωματιδιακή ακτινοβολία είτε με ραδιοϊσότοπα που εκπέμπουν ηλεκτρόνια β- και α σωματιδιακή ακτινοβολία για διάγνωση και θεραπεία αντίστοιχα καρκινικών όγκων. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να εξετάσει εάν η παρεμβολή ή μη ενός βασικού συνδετικού μορίου πεπτιδικής φύσεως μεταξύ του σχηματιζόμενου συμπλόκου του Τεχνητίου και της φαρμακολογικά δραστικής ομάδας του πεπτιδίου Μπομπεσίνης επηρεάζει τη φαρμακοκινητική συμπεριφορά των νέων ενώσεων, για εξειδικευμένη στόχευση καρκίνου του προστάτη. Στα πλαίσια της παραπάνω μελέτης έχουν συντεθεί με την μέθοδο πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση και έχουν μελετηθεί δυο ανάλογα του τύπου: Gly-Gly-Cys-X-BN[2-14] όπου, είτε το συνδετικό μόριο δεν υπάρχει: Χ=0 ΒΝ(Ι), είτε αυτό είναι: X=Orn-Orn-Orn (Orn: α,δ-διαμινοβαλερικό οξύ ή 2,5 διαμινοπεντανοϊκό οξύ ή ορνιθίνη) ΒΝ(ΙΙ). Τα παράγωγα του Τεχνητίου, των δύο νέων πεπτιδικών (ΒΝ) μορίων, 99mTc-BN(Ι) και 99mTc-BN(ΙΙ), ελήφθησαν με ραδιοχημική καθαρότητα >98% και με σχεδόν ίδιους χρόνους έκλουσης από τη στήλη RP-HPLC με αυτούς των αντίστοιχων συμπλόκων του Ρηνίου 185/187Re-BN(Ι) και 185/187Re-BN(ΙΙ) τα οποία χαρακτηρίστηκαν με MS-ESI. Η μεταβολική σταθερότητα βρέθηκε υψηλή στο πλάσμα, μέτρια σε εναιώρημα καρκινικών κυττάρων του προστάτη (PC-3) και σχετικά χαμηλή σε ομογενοποίημα ήπατος και νεφρών. Το παράγωγο 99mTc-BN(I) ήταν λιγότερο σταθερό στο εναιώρημα κυττάρων και στο ομογενοποίημα ήπατος σε σχέση με το 99mTc-ΒΝ(ΙΙ). Ικανοποιητική κρίθηκε η συγγένεια δέσμευσης (της τάξης των nM) με τους GRP-Rs υποδοχείς, και των δύο παραγώγων, καθώς και των συμπλόκων τους με 185/187Re. Το BN(II) εμφανίζει την υψηλότερη συγγένεια. To ποσοστό της εσωτερικοποιημένης ραδιενέργειας στα καρκινικά κύτταρα PC-3 μετά την επώαση τους με το 99mTc-ΒΝ(Ι) ήταν ~6% και με το 99mTc-ΒΝ(ΙΙ) ~25%. Η in vivo αξιολόγηση σε φυσιολογικά πειραματόζωα τύπου Swiss και σε παθολογικά πρότυπα καρκίνου του προστάτη, σε πειραματόζωα τύπου SCID, έδειξε ότι το 99mTc-BN(II) παρουσίασε υψηλότερη συγκέντρωση στο πάγκρεας και στον όγκο σε σχέση με το 99mTc-BN(I). Με τη σπινθηρογραφική δυναμική μελέτη σε παθολογικά πρότυπα καρκίνου του προστάτη μετά τη χορήγηση με 99mTc-ΒΝ(Ι) και 99mTc-BN(II), ελήφθησαν ευκρινείς εικόνες του όγκου, ιδιαίτερα για το 99mTc-BN(II). Εν κατακλείδι, η διεξοδική μελέτη των δύο νέων παραγώγων N3S-X-BN[2-14] έδειξε ότι η υδροφιλικότητα και το φορτίο επηρεάζουν σημαντικά τις in vitro και in vivo ιδιότητες δέσμευσης και την φαρμακοκινητική των παραγώγων της Μπομπεσίνης.