Μοριακή ανάλυση και εξέλιξη γονιδίων παγοπυρήνωσης

Abstract

Bacterial ice nucleation is a common occurrence in nature and is known since 1973. Especially, certain Gram-negative species belonging to the genera Pseudomonas, Pantoea and Xanthomonas may trigger crystallization of water at temperatures just below 0oC. Most of these bacterial species are common plant pathogens or non-pathogenic plant epiphytes and they are responsible for frost damage to agronomic crops. The bacterial ice nucleation phenotype is due to the function of a unique membrane-associated protein, product of a single gene, which is highly conserved among the ice nucleating bacteria. In an attempt to study the existence of such bacteria and the dissemination of ice nucleation genes in the Greek environment we isolated ice–nucleation active bacteria from the foliage of orange trees or potatoes in frost damaged areas of Arta, Epirus. Strains Ina1 and Ina4 were isolated from orange tree leaves whereas strain Ina5 was isolated from potato leaves. Additionally, three strains named Act34, K1/KB1 and K8/A1 were donated by Prof. H. A. Constandinidou (Dept. of Agriculture, Aristoteleian University of Thessaloniki). Strains Act34, K1/KB1 and K8/A1 were isolated from leaves of Kiwi, tobacco and dill plants, respectively. Morphological and biochemical tests assigned these strains as Gram-negative rods belonging to the genera Pseudomonas (Ina1, Ina4, Act34, K1/KB1 and K8/A1) or Pantoea (Ina5). Molecular analysis of 16S rRNA gene sequences (1500 bp- long) of all strains confirmed that strains Ina1, Ina4, Act34 and K1/KB1 showed homology 99% with Pseudomonas syringae, whereas strains K8/A1 and Ina5 showed 99% homology with Pseudomonas viridiflava and Pantoea ananatis, respectively. Strains Ina1, Ina4, Act34 and K1/ΚΒ1 were identified as different strains of the same species, P. syringae, based on ERIC- and BOX- PCR analysis. From the analysis of the ice nucleating strains we may conclude that as it appears world – wide the ice nucleating bacteria in Greece are also predominated 249 by strains of the genus Pseudomonas with most common those of the plant pathogen P. syringae. Only one of our strains was found to be close to Pantoea ananatis (previously Known as Erwinia ananas ). Ice nucleating gene fragments were amplified, cloned and partially sequenced from all the above strains, except K8/A1 which was identified as P. viridiflava. The analysis of their sequences was in compliance with the taxonomical identification of the strains, as the genes ice1, ice4, iceact34 and icekb1 grouped well with genes of P. syringae (inaZ, inaV, inaK, inaQ), whereas the ice5 appeared closer to genes of Pantoea species (inaA, inaU, iceE). Furthermore, the determination of the complete nucleotide sequence of the genes ice1 and ice4 confirmed that they are new genes, which showed 97-98 % homology with the genes inaQ and inaZ, respectively. Comparison of the above sequences revealed that the relative length of the central repetitive domain (R-domain) of the genes ice1 and ice4 was longer than that of the genes inaQ and inaZ. Finally, genomic libraries of the strains Ina1, Ina4, K8/A1 and Ina5 were constructed in the cosmid vector pLAFR5. These libraries will be used not only for the isolation of new ice nucleation genes but also for the analysis of genomic regions that flank these genes. They can also be a valuable source for the isolation of other pathogenicity genes of these strains.

Το φαινόμενο της βακτηριακής παγοπυρήνωσης είναι γνωστό από 1973 και είναι ευρέως διαδεδομένο στη φύση. Ειδικότερα, ορισμένα Gram- αρνητικά βακτήρια που ανήκουν στα γένη Pseudomonas, Pantoea Xanthomonas συμβάλλουν στο σχηματισμό πυρήνων πάγου σε θερμοκρασίες λίγο κάτω από τους 0οC. Τα περισσότερα από αυτά είναι παθογόνα ή μη, επιφυτικά βακτήρια του υπέργειου τμήματος των φυτών ευθύνονται για ζημιές που προκαλούνται στις γεωργικές καλλιέργειες πρώιμους ή όψιμους παγετούς. Η έκφραση του φαινοτύπου της βακτηριακής παγοπυρήνωσης είναι αποτέλεσμα της δράσης μιας πρωτεΐνης που βρίσκεται στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη, προϊόν γονιδίου (ice ή ina), το οποίο εμφανίζεται αρκετά συντηρημένο ανάμεσα στα διάφορα παγοπυρηνωτικά βακτήρια. Στα πλαίσια της μελέτης της ύπαρξης τέτοιων βακτηρίων καθώς και της διασποράς των γονιδίων παγοπυρήνωσης στον Ελλαδικό χώρο απομονώθηκαν βακτήρια παγοπυρηνωτική δράση από γεωργικές καλλιέργειες που βρίσκονταν παγετόπληκτες περιοχές του Νομού Άρτας της περιφέρειας Ηπείρου. στελέχη Ina1 και Ina4 που απομονώθηκαν από φύλλα πορτοκαλιάς και στέλεχος Ina5 από φύλλα φυτού πατάτας επιλέχθηκαν για παραπέρα μελέτη. Επίσης, συμπεριλήφθηκαν τρία στελέχη, Act34, K1/KB1, K8/A1, προσφέρθηκαν από την καθ. κ. Κωνσταντινίδου (τμήμα Γεωπονίας, ΑΠΘ) και προέρχονταν από φύλλα ακτινιδιάς (Act34), φύλλα καπνού ΚΒ1) και φύλλα άνηθου (Κ8/Α1). Ο φυλογενετικός χαρακτηρισμός των νέων στελεχών βασίσθηκε κυρίως στη μοριακή ταυτοποίηση με τη νουκλεοτιδική ανάλυση περιοχών 16S rDNA. Σύμφωνα με την παραπάνω ανάλυση τα στελέχη Ina1, Ina4, Act34 και K1/KB1 αποτελούν μια φυλογενετική ομάδα που βρίσκεται πλησιέστερα σε στελέχη του Pseudomonas syringae το στέλεχος Κ8/Α1 βρίσκεται πλησιέστερα σε στελέχη του Pseudomonas viridiflava και το στέλεχος Ina5 βρίσκεται πλησιέστερα σε στελέχη του Pantoea ananatis. 247 Στον παραπάνω χαρακτηρισμό συνηγορούν και τα αποτελέσματα από την ταξινόμηση με βάση τα μικροβιολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων. Τα στελέχη Ina1, Ina4, Act34 και Κ1/ΚΒ1 που ταυτοποιήθηκαν ως P. syringae φαίνεται πως ανήκουν σε διαφορετικούς γονότυπους όπως προκύπτει από την ανάλυση των BOX – και ERIC-PCR αποτυπωμάτων DNA. Στη συνέχεια αλληλουχίες γονιδίων παγοπυρήνωσης ενισχύθηκαν και απομονώθηκαν από τα στελέχη Ina1, Ina4, Ina5, Act34 και Κ1/ΚΒ1, εφαρμόζοντας την τεχνική PCR. Τα ενισχυμένα τμήματα (μεγέθους ~3800 bp) κλωνοποιήθηκαν στο φορέα pCR-Blunt (invitrogen) και ακολούθησε μερική ανάγνωση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Από την ανάλυση των παραπάνω αλληλουχιών προκύπτει μια διασπορά των γονιδίων ina ανάλογη με αυτή των γονιδίων 16S rRNA. Tα γονίδια ice1, ice4, icekb1 και iceact34 τοποθετούνται πλησιέστερα σε γονίδια που έχουν απομονωθεί από στελέχη του P. syringae, σχηματίζοντας μία ομάδα, ενώ το γονίδιο ice5 ομαδοποιείται καλά με τα γονίδια ina που προέρχονται από βακτήρια του γένους Pantoea. Επιπλέον, ο προσδιορισμός της πλήρους νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδίων ice1 και ice4 επιβεβαίωσε ότι πρόκειται για νέα γονίδια, τα οποία παρουσιάζουν υψηλή ομολογία με τα γονίδια inaQ και inaZ, αντίστοιχα.