Επίδραση των πεπτιδίων του γάλακτος στο ανοσολογικό σύστημα του χοίρου

Abstract

The effect of milk peptides on several critical parameters of the immune system of weaned piglets was studied in three independent experiments, using a combination of in vitro and in vivo methodologies. In the first experiment, we examined the in vitro effect of two synthetic peptides on several functional properties of phagocytes obtained from the systemic circulation of weaned piglets. The two peptides utilized were the tripeptide LLY which corresponds to residues 191-193 of bovine β-casein and the hexapeptide PGPIPN which corresponds to residues 63-68 of bovine β-casein. The effectiveness of these synthetic peptides on the enzymatic system of urokinase plasminogen activator and its receptor (u-PA/u-PAR), the superoxide anion (SA) production as well as the expression of major histocompatability complex (MHC) class II antigens was studied. In this model system, phagocytes were obtained at weaning which is considered a period of immaturity of the immune system and 4 weeks later when the immune system is thought to have gained its full functionality. Results showed that both peptides were effective on the enzymatic system of u-PA/u-PAR, by reducing total cell-associated, membrane-bound activity of u-PA and u-PA free binding sites on the surface of macrophages activated by phorbol myristate acetate (PMA), only at the time of weaning and not 4 weeks later. Similarly, both peptides reduced SA production as well as the expression of MHC class II antigens on the surface of the activated macrophages at the same period. Only the tripeptide LLY suppressed the u-PA system and SA production of PMA-stimulated neutrophils during the same time period. None of the peptides tested had any effect on the u-PA system and SA production of PMA-stimulated macrophages and neutrophils isolated from the same piglets during weeks 5-6 post weaning. Furthermore, the two peptides affected the above functional properties of phagocytes by regulating the system of protein kinase A or/and exchange protein directly activated by cAMP-1 (Epac-1). The second experiment examined the in vitro effect of different peptidic fractions on the u-PA/u-PAR system and SA production by phagocytes and the expression of MHC class II antigens on the surface of macrophages obtained from the systemic circulation of piglets for a period of 2 weeks after weaning. The peptides which were tested were the peptidic fractions corresponding to the peaks obtained through Sephadex G-25 and G-50 liquid chromatography followed by size exclusion high performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that only the peptidic fractions containing low molecular weight peptides were effective by reducing membrane-bound activity of u-PA and SA production of PMA-stimulated macrophages and neutrophils. Furthermore, the most effective peptidic fraction suppressed the u-PA/u-PAR system and SA production by regulating the PKA system.

Η επίδραση των πεπτιδίων του γάλακτος σε κρίσιμες παραμέτρους του ανοσολογικού συστήματος απογαλακτισμένων χοιριδίων μελετήθηκε με τρία ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό in vitro και in vivo μεθοδολογιών. Στο πρώτο πείραμα μελετήθηκε in vitro η επίδραση δυο συνθετικών πεπτιδίων του γάλακτος, του τριπεπτιδίου Lys-Lys-Tyr (LLY) και του εξαπεπτιδίου Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn (PGPIPN), που αντιστοιχούν στα τμήματα 191-193 και 63-68 της βόειας β-καζεΐνης αντίστοιχα, στο σύστημα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (ΕΠ-Ο) και την παραγωγή ανιόντων υπεροξειδίου του υδρογόνου (ΑΥ) από φαγοκύτταρα που αποκτήθηκαν από το αίμα απογαλακτισμένων χοιριδίων, για μια περίοδο 6 εβδομάδων μετά τον απογαλακτισμό. Μελετήθηκε, ακόμη, η επίδραση των δυο παραπάνω πεπτιδίων στην παρουσία των πρωτεϊνών του Μείζονος Συστήματος Ιστικής Συμβατότητας τάξεως ΙΙ (ΜΣΙΣ τάξεως ΙΙ) σε μακροφάγα που αποκτήθηκαν από το αίμα απογαλακτισμένων χοιριδίων την ίδια χρονική περίοδο. Από τα αποτελέσματα των in vitro πειραμάτων προέκυψε πως τα δυο πεπτίδια επέδρασαν στις παραμέτρους που μελετήθηκαν μόνο για το χρονικό διάστημα των 2 πρώτων εβδομάδων μετά τον απογαλακτισμό των χοιριδίων. Συγκεκριμένα, τα δυο πεπτίδια ήταν δραστικά στα ενεργοποιημένα με οξική μυριστική φορβόλη μακροφάγα που αποκτήθηκαν από τα χοιρίδια τις 2 πρώτες εβδομάδες μετά τον απογαλακτισμό τους, προκαλώντας μείωση των τιμών στο σύστημα του ΕΠ-Ο (συνολική ενεργότητα του ΕΠ-Ο, ενεργότητα του ενζύμου στην κυτταρική μεμβράνη, ελεύθερες θέσεις ΕΠ-Ο), την παραγωγή ΑΥ αλλά και των πρωτεϊνών του ΜΣΙΣ τάξεως ΙΙ. Για το ίδιο χρονικό διάστημα μόνο το τριπεπτίδιο LLY ήταν δραστικό στα ενεργοποιημένα με οξική μυριστική φορβόλη ουδετερόφιλα, μειώνοντας τις τιμές της συνολικής κυτταρικής ενεργότητας και της ενεργότητας του ΕΠ-Ο στην κυτταρική τους μεμβράνη αλλά και την παραγωγή ΑΥ. Στα φαγοκύτταρα που αποκτήθηκαν από το αίμα απογαλακτισμένων χοιριδίων την 5η-6η εβδομάδα μετά τον απογαλακτισμό τους, κανένα πεπτίδιο δεν ήταν δραστικό. Περαιτέρω, μελετήθηκε ο μηχανισμός μέσω του οποίου έδρασαν τα δυο πεπτίδια στις προαναφερθείσες παραμέτρους. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων προέκυψε πως η επίδραση των πεπτιδίων στο σύστημα του ΕΠ-Ο στα φαγοκύτταρα των χοιριδίων προϋποθέτει την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA), ενώ η επίδρασή τους στην παραγωγή ΑΥ προϋποθέτει την ενεργοποίηση του συστήματος της PKA ή/και ενός εναλλακτικού “μονοπατιού” μεταβίβασης μηνυμάτων στο οποίο εμπλέκεται η Πρωτεΐνη Ανταλλαγής-1 Ενεργοποιημένης από το cAMP (Epac-1). Η επίδραση, τέλος, των πεπτιδίων στην παρουσία των πρωτεϊνών του ΜΣΙΣ τάξεως ΙΙ στην κυτταρική μεμβράνη των ενεργοποιημένων μακροφάγων είναι ανεξάρτητη του συστήματος της PKA ή/και της Epac-1.