Μελέτη συνδυαστικής δράσης φωτοδυναμικής θεραπείας και αντιοξειδτικών σε καρκίνο του δέρματος με χρήση φωτοφυσικών μεθόδων

Abstract

The aim of the present thesis is the development of a topical non melanoma skin carcinomas photodynamic therapy system, and the further improvement of its results with parallel administration of antioxidants. The thesis consists of four sections. Firstly, non melanoma skin carcinomas and healthy skin animal models, which present high phenotypic similarity with human skin, were developed. In such models, preventive, diagnostic and therapeutic methodologies and their mechanisms can be studied. In addition, their results can be exploited to clinical level (clinical studies). Thus, two models of hairless mice with and without melanin were chosen and two methodologies of non melanoma skin cancer initiation (with UV radiation and combination of UV radiation with carcinogenic chemical substance) were developed. Then, a noninvasive diagnostic method, which is based on fluorescence spectroscopy, was developed. This method contributes to the early diagnosis of non melanoma skin cancer and minimizes the danger of tumor injuring due to repeated biopsies (biopsy is considered the cold standard). In parallel, diagnostic algorithms for the categorization of healthy skin and non melanoma skin carcinomas, with higher accuracy than biopsy and in real time, were developed. Another task of this research is the development of a system for topical photodynamic therapy (photosensitizer-irradiation-protocol) with specific characteristics. For this reason, a second generation photosensitizer, chloro- aluminum phthalocyanine, was chosen. Its photophysical properties were studied and compared with those of 5, 10, 15, 20-tetra (3-hydroxyphenyl) -2,3, dihydropoprhyrin which is already used in clinical practice and is considered one of the most efficient photosensitizers. A special formulation of photosensitizer for topical application was synthesized and its pharmacokinetics were studied. For these studies appropriate methodologies and devices, for the extraction of tissues and solutions spectroscopic characteristics, were developed. Furthermore, an irradiation system for photodynamic therapy and a system for digital imaging of skin tumors were designed and developed. The irradiation system is consisted of a new generation diode laser of high power (1 W) emitting at 670 nm and a system for the delivery and diffusion of radiation. By using digital imaging system the basic geometrical characteristics of tumors can be recorded for the follow up during the therapy. This system consists of a CCD camera, stereotactic devices and appropriate software for image acquisition and processing. Moreover, the activity of a physical polyphenolic extract (rich in antioxidant properties) was studied. From these studies it was found that this antioxidant mixture presents antioxidant, antiaging and anticancer action when administrated at low doses. This action is inverted when it was administrated at higher doses (pro-oxidant). Thus, the possible synergetic action of antioxidants (at pro-oxidant doses) with photodynamic therapy was investigated. The results obtained from these studies support the theory of synergistic action of antioxidants (in pro-oxidant doses) with the cancer therapies which are based on free radicals mechanisms. The results were processed theoretically, statistically and compared with the results of relevant studies as these are presented in the international literature. This thesis contributes significantly to the improvement of topical photodynamic therapy of non melanoma skin cancer, to the safe and on time diagnosis of non melanoma skin carcinomas and to the production of new knowledge and understanding of pro-oxidant and antioxidant mechanisms of action of a very important antioxidant substances group, polyphenolics. The results of the thesis can also contribute to the improvement of traditional cancer therapies which act through free radical mechanisms.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη συστήματος τοπικής φωτοδυναμικής θεραπείας με φθαλοκυανίνες μη μελανωματικών δερματικών καρκινικών όγκων και η περαιτέρω βελτίωση των θεραπευτικών αποτελεσμάτων του συστήματος αυτού μέσω παράλληλης χορήγησης αντιοξειδωτικών. Το αντικειμένου της διατριβής αναπτύσσεται σε τέσσερεις τομείς. Αρχικά, επιδιώχθηκε να αναπτυχθούν in vivo μοντέλα μη μελανωματικού καρκίνου αλλά και υγιούς δέρματος, τα οποία φαινοτυπικά θα παρουσίαζαν σημαντικές ομοιότητες με το ανθρώπινο δέρμα. Σε τέτοια μοντέλα μπορούν να μελετηθούν προληπτικές, διαγνωστικές, θεραπευτικές μέθοδοι καθώς και οι μηχανισμοί δράσης τους και τα αποτελέσματα να αξιοποιηθούν σε κλινικό επίπεδο (στάδια κλινικών μελετών). Στα πλαίσια αυτών των μελετών επελέγησαν μοντέλα άτριχων μυών με και χωρίς μελανίνη και αναπτύχθηκαν δύο μεθοδολογίες επαγωγής μη μελανωματικού καρκίνου του δέρματος (με UV ακτινοβολία και με συνδυαστική δράση UV ακτινοβολίας και καρκινογενούς χημικής ένωσης). Εν συνεχεία, αναπτύχθηκε μη επεμβατική οπτική διαγνωστική μέθοδος, η οποία βασίζεται σε φασματοσκοπική διάταξη φθορισμού. Η μέθοδος αυτή συνεισφέρει στην έγκαιρη διάγνωση μη μελανωματικού δερματικού καρκίνου αλλά και ελαχιστοποιεί τους κινδύνους που συνεπάγεται η λήψη επαναλαμβανομένων βιοψιών για υποτροπή του καρκινώματος (η βιοψία μέχρι σήμερα θεωρείται η μέθοδος με τα πιο αξιόπιστα αποτελέσματα). Ταυτόχρονα αναπτύχθηκαν διαγνωστικοί αλγόριθμοι για την κατηγοριοποίηση μη μελανωματικών δερματικών καρκινωμάτων και υγιών δερματικών ιστών με ποσοστά επιτυχίας μεγαλύτερα από αυτά της βιοψίας και σε πραγματικό χρόνο. Ένας άλλος στόχος της παρούσας έρευνας ήταν η ανάπτυξη θεραπευτικού συστήματος τοπικής φωτοδυναμικής θεραπείας (φωτοευαισθητοποιητής-ακτινοβολητική διάταξη-πρωτόκολλο) με εξειδικευμένα χαρακτηριστικά. Για το λόγο αυτό επελέγη ένας φωτοευαισθητοποιητής δεύτερης γενιάς, η χλωρο-αλουμινο-φθαλοκυανίνη και μελετήθηκαν οι φωτοφυσικές ιδιότητές της και συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες της 5, 10, 15, 20-τετρα(3-υδροξυφαινυλ)-2,3 διυδροπορφυρίνης η οποία έχει ήδη εγκριθεί και θεωρείται από τους πλέον ενδεδειγμένους φωτοευαισθητοποιητές. Ακολούθως, παρασκευάστηκε ειδικό σκεύασμα φωτοευαισθητοποιητή κατάλληλο για τοπική χορήγηση και μελετήθηκε φαρμακοκινητικά. Για τις μελέτες αυτές αναπτύχθηκαν μεθοδολογίες αλλά και διατάξεις κατάλληλες για την εξαγωγή των φασματοφωτομετρικών χαρακτηριστικών ιστών και διαλυμάτων. Παράλληλα, σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν σύστημα ακτινοβόλησης και διάταξη οπτικής ψηφιακής απεικόνισης δερματικών όγκων. Το σύστημα ακτινοβόλησης αποτελείται από ένα διοδικό laser νέας γενιάς, υψηλής ισχύος 1W και μήκους κύματος 670 nm το οποίο συνδέεται με συστήματα μεταφοράς και διάχυσης της οπτικής ακτινοβολίας. Μέσω της διάταξης οπτικής απεικόνισης ιστών καθίσταται δυνατή η απεικόνιση των όγκων αλλά και η καταγραφή βασικών γεωμετρικών χαρακτηριστικών των όγκων κρίσιμων για την παρακολούθηση της εξέλιξης της θεραπείας. Η διάταξη οπτικής απεικόνισης δερματικών όγκων αποτελείται από μία CCD κάμερα, στερεοτακτικές διατάξεις και κατάλληλο λογισμικό λήψης και επεξεργασίας των εικόνων. Ακόμη, μελετήθηκε η δράση φυσικού πολυφαινολικού εκχυλίσματος (πλούσιου σε αντιοξειδωτικές ιδιότητες). Διαπιστώθηκε ότι όταν το μίγμα αυτό χορηγηθεί σε μικρές συγκεντρώσεις, σε in vivo μοντέλα μη μελανωματικού καρκίνου του δέρματος, παρουσιάζει αντιοξειδωτική, αντιγηραντική και αντικαρκινική δράση. Η δράση αυτή αντιστρέφεται όταν χορηγηθεί τοπικά σε υψηλές δόσεις (προ-οξειδωτική). Λόγω αυτών των αποτελεσμάτων εξετάστηκε η πιθανότητα συνεργειακής δράσης του μίγματος αντιοξειδωτικών (σε προ-οξειδωτικές δόσεις) με τη φωτοδυναμική θεραπεία. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις αντίστοιχες μελέτες ενισχύουν τη θεωρία συνεργειακής δράσης αντιοξειδωτικών σε προ-οξειδωτικές δόσεις και θεραπειών που δρουν μέσω μηχανισμών ελευθέρων ριζών. Τα αποτελέσματα όλων των προαναφερθέντων μελετών επεξεργάστηκαν θεωρητικά, στατιστικά και συγκρίθηκαν με αποτελέσματα παρόμοιων ερευνών τα οποία παρουσιάζονται στη διεθνή βιβλιογραφία. Βάσει των συμπερασμάτων που εξάγονται από αυτή τη θεωρητική μελέτη προκύπτει ότι η διατριβή αυτή συνεισφέρει σημαντικά στη βελτιστοποίηση της τοπικής φωτοδυναμικής θεραπείας μη μελανωματικού καρκίνου, στην έγκαιρη και ασφαλή διάγνωση του αλλά και στην παραγωγή νέας γνώσης και κατανόησης μηχανισμών προ-οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής δράσης μιας από τις σημαντικότερες ομάδες αντιοξειδωτικών, των πολυφαινολών. Τα αποτελέσματα αυτά είναι πρωτότυπα διεθνώς και μπορούν εκτός από τη βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων της φωτοδυναμικής θεραπείας να συνεισφέρουν και στη βελτιστοποίηση των κλασικών θεραπειών του καρκίνου που δρουν μέσω μηχανισμών ελευθέρων ριζών.