Χαρακτηρισμός και μελέτη της κινάσης πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αργινίνης / σερίνης του αμινοτελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β

Abstract

In the present thesis, we purified and characterized a serine/arginine protein kinase activity from rat testis cytosolic extracts, that is responsible for the phosphorylation of the Nterminal domain of LBR. The phosphorylating activity was purified using two column chromatography steps, consisting of the ion exchanger P-cellulose and an Affigel-10 column containing a synthetic peptide with the RS region of LBR. As substrates we used the Nterminal domain of LBR expressed in bacteria as a GST fusion protein (GST-wtNt) and a similar fusion protein lacking the RS dipeptides (GST-ΔRS). The purified activity was characterized and identified as SRPK1, using western blotting analysis, GST pull down assays, phosphopeptide mapping and in vitro phosphorylation of RS domain containing substrates. In a following step, we showed that the N-terminal domain of LBR binds to p32, whereas a mutated domain lacking the RS region does not. Phosphorylation of LBR by SRPK1 completely abolishes binding of p32, suggesting that this enzyme regulates interactions among the components of the LBR complex. Moreover, we demonstrated that binding of p32 completely inhibits binding of SRPK1 and the subsequent phosphorylation of LBR, suggesting that p32 protein actually competes with SRPK1 for the RS domain of LBR. Since SRPK1, LBR and p32 are highly expressed in testis we decided to study their distribution during spermatogenesis. At the beginning of the elongation process LBR exhibited a peripheral, nuclear envelope distribution. With the progression of spermiogenesis a polarization of the signal to one half of the nuclear periphery was apparent. Finally, in elongated spermatids the signal was almost restricted mainly to the posterior pole of the nucleus. The redistribution of the p32 protein was impressive. P32 had a perinuclear localization, similarly to LBR, during the initial stages of the elongating process, then this protein entered the central area of the nucleus and finally, p32 exhibited a clear acrosomal localization in elongated spermatids. Mammalian SRPK1 has been considered as a constitutively active protein kinase. In the present thesis, recombinant GST-SRPK1 was used as substrate to identify potential protein kinase(s) in testis extracts, involved in phosphorylating and thereby regulating the activity of this enzyme. Using ion exchange chromatography (P-cellulose) and the affinity column Affigel-casein we purified a kinase activity that was able to specifically phosphorylate SRPK1. This activity was further characterized as casein kinase II (CK2) by means of immunoblot analysis, inhibition by heparin and phosphopeptide mapping. Phosphorylation of SRPK1 by CK2 occurred mainly at serines 51 and 555 and resulted in approximately 5-6 fold activation of the enzyme. Finally, in immunofluorescence studies preformed by Assistant Professor Th. Papamarkaki, it was also observed that SRPK1 phosphorylation by CK2 resulted in the partial localization of the wild type form of SRPK1 in nuclear speckles. On the other hand the SPRK1A51 mutant, in which Ser51 was mutated to Ala, showed a clear cytoplasmic localization.

Στην παρούσα εργασία καθαρίστηκε και χαρακτηρίστηκε από κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου η δραστικότητα RS κινάσης πρωτεϊνών, η οποία είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση της αλληλουχίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης του αμινο-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β. Επίσης μελετήθηκε ο ρόλος της φωσφορυλίωσης στη ρύθμιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της πρωτεΐνης p32 και της RS ακολουθίας του LBR αλλά και αντίστροφα πως η αλληλεπίδραση αυτή επιτρέπει ή μη, τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Δεδομένου ότι η SRPK1 εκφράζεται κατά κύριο λόγο στους όρχεις αλλά και τα επίπεδα των LBR και p32 στο συγκεκριμένο ιστό είναι σχετικά υψηλά έγιναν μελέτες της κατανομής των πρωτεϊνών αυτών σε ιστούς όρχεων, σε μία πρώτη προσέγγιση για την αποσαφήνιση του ρόλου τους κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης. Τέλος ένας άλλος σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ρύθμιση της δραστικότητας της SRPK1 μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων και συγκεκριμένα της φωσφορυλίωσης της από άλλες κινάσες πρωτεϊνών. Για τον καθαρισμό της δραστικότητας κινάσης απέναντι στο αμινο-τελικό άκρο του LBR χρησιμοποιήθηκαν δύο στήλες χρωματογραφίας, ο κατιονικός ανταλλάκτης φωσφοκυτταρίνη και μία στήλη αγχιστείας που παρασκευάστηκε με τη σύνδεση ενός πεπτιδίου που περιέχει την RS ακολουθία LBR σε υλικό Affigel-10. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το αμινο-τελικό άκρο του LBR εκφρασμένο σε βακτήρια ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST (GST-wtNt). Στη συνέχεια η δραστικότητα αυτή χαρακτηρίστηκε χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοανίχνευσης, ιn situ επαναφορά ενζυμικής δράσης μετά από SDS ηλεκτροφόρηση, τεχνικές συγκατακρήμνισης, συγκριτικής ανάλυσης φωσφοπεπτιδίων και in vitro φωσφορυλίωσης διαφόρων υποστρωμάτων που περιέχουν RS ακολουθίες. Το αποτέλεσμα της παραπάνω ανάλυσης έδειξε ότι η εκλουόμενη αυτή δραστικότητα ήταν η SRPK1, μία ήδη γνωστή κινάση πρωτεϊνών που φωσφορυλιώνει τα υποστρώματα της σε ακολουθίες αργινίνης/σερίνης. Σε ένα επόμενο στάδιο μελετήθηκε η επίδραση που έχει η φωσφορυλίωση του υποδοχέα στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων του με την πρωτεΐνη p32, ένα άλλο μέλος του συμπλόκου του LBR. Η φωσφορυλίωση της RS αλληλουχίας από την κινάση παρεμποδίζει τη δέσμευση της πρωτεΐνης p32, ενώ και η δέσμευση της πρωτεΐνης p32 παρεμποδίζει τη δέσμευση της κινάσης και την ακόλουθη φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Η μελέτη της κατανομής των πρωτεϊνών αυτών κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης έδειξε ότι η κινάση πρωτεϊνών SRPK1 εντοπίζεταισε όλα τα στάδια της σπερματογένεσης, εκτός από τα ώριμα σπερματόζωα. Όσον αφορά τον υποδοχέα της λαμίνης Β αυτός έχει περιπυρηνική εντόπιση κατά την έναρξη της σπερμιογένεσης και ακολουθεί τη σταδιακή μετατόπιση του πυρηνικού φακέλου προς το πίσω τμήμα (posterior pole) των ώριμων σπερματόζωων στο τέλος της διαφοροποίησης. Η πρωτεΐνη p32 αν και στα αρχικά στάδια της επιμήκυνσης των σπερματίδων εντοπίζεται περιπυρηνικά όπως και ο LBR, στη συνέχεια μετατοπίζεται προς το πυρηνόπλασμα ενώ εμφανίζει εξ’ ολοκλήρου ακροσωμική εντόπιση στα ώριμα σπερματόζωα. Σε ένα δεύτερο στάδιο της παρούσας εργασίας μελετήθηκε η ρύθμιση της δράσης της SRPK1 από άλλες κινάσες πρωτεϊνών. Τόσο σε κυτταρόπλασμα όρχεων αρουραίου όσο και σε ευκαρυωτικά κύτταρα Hela αρχικά βρέθηκε μία δραστικότητα που φωσφορυλιώνει έντονα την SRPK1. Η δραστικότητα αυτή μετά από καθαρισμό με στήλες χρωματογραφίας φωσφοκυτταρίνη και Affigel-καζεΐνη ταυτοποιήθηκε ως η κινάση της καζεΐνης 2. Επίσης εντοπίστηκαν οι σερίνες 51 και 555 ως οι κύριες θέσεις φωσφορυλίωσης του μορίου της SRPK1 από την CK2. Με τη βοήθεια κατάλληλων μεταλλαγμάτων βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση της SRPK1 από την CK2, έχει ως αποτέλεσμα τη ρύθμιση της δραστικότητας της SRPK1 αυξάνοντας τη δράση της απέναντι στο GST-wtNt κατά 5-6 φορές. Τέλος, πειράματα ανοσοφθορισμού που έγιναν από την Eπικ. Καθηγήτρια Θ. Παπαμαρκάκη, έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της SRPK1 από την CK2, έχει ως αποτέλεσμα τη μερική εντόπιση της φυσιολογικής μορφής της κινάσης στον πυρήνα υπό τη μορφή κηλίδων, ενώ αντίθετα το μετάλλαγμα της, SRPK1A51, εντοπίζεται εξολοκλήρου στο κυτταρόπλασμα.