ΔΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΚΟΙΝΗΣ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΩΝ RNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΩΝ RPB8

Abstract

Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ RPB8 ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΑΠΟ ΤΙΣ ΠΕΝΤΕ ΚΟΙΝΕΣ ΥΠΟΟΜΑΔΕΣ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ RNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΩΝ ΟΛΩΝ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΟΤΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ. ΣΤΟΝ ΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΕΝΑ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑ. Η ΔΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΟΜΟΛΟΓΗΣ ΤΗΣ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ Η ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΗΣ ΤΗΣ ΣΤΗΝ RNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΡΧΑΙΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΥΠΟΔΗΛΩΝΟΥΝ ΤΟΝ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ,ΑΛΛΑ ΑΚΟΜΗ ΑΓΝΩΣΤΟ, ΡΟΛΟ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΙΩΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΕΙΔΙΚΑ. ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΘΗΚΕ ΤΟ CDNA ΠΟΥ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΕΙ ΤΗΝ ΟΜΟΛΟΓΗ ΤΗΣ RPD8 ΣΤΟΝ ΣΧΙΖΟΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ ΩΣ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑΣ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗΣ GCN2 ΤΟΥ ΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ. ΔΙΑΠΙΣΤΩΘΗΚΕ ΟΤΙ ΟΙ ΔΥΟ ΟΜΟΛΟΓΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΜΟΛΟΝΟΤΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΟΥΝΜΕΓΑΛΟ ΒΑΘΜΟ ΟΜΟΙΟΤΗΤΑΣ (42% ΤΑΥΤΟΣΗΜΑ ΑΜΙΝΟΞΕΑ), ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΑΝΤΑΛΛΑΞΙΜΕΣ. Η RPD8 ΤΟΥ ΣΧΙΖΟΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ ΟΤΑΝ ΕΚΦΡΑΖΕΤΑΙ ΣΤΟΝ ΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΖΕΤΑΙ ΤΗΝ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΔΟΓΕΝΟΥΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ MRNA GCN4, ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΟΝΤΑΣ ΜΕ ΑΥΤΟ ΤΟΝ ΤΡΟΠΟ ΤΗΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ GCN2. Η ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΑΝΕΙ ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΤΗΝ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΤΟΥ MRNA GCN4 ΚΑΙ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΑΡΓΟ ΡΥΘΜΟ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΚΡΥΟΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΤΟΣΟ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΟΥ ΦΕΡΝΟΥΝ ΤΗΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ GCN2 ΟΣΟ ΚΑΙ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΓΡΙΟΥ ΤΥΠΟΥ. Η ΔΟΜΙΚΗ ΟΜΟΙΟΤΗΤΑ ΚΑΙ Η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΔΥΟ ΟΜΟΛΟΓΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥΣ ΣΤΟ ΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ. ΑΠΟΔΕΙΧΘΗΚΕ ΟΤΙ Η ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΩΝ 20 ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ (68-88) ΤΗΣ RPB8, Η ΟΠΟΙΑ ΛΕΙΠΕΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΜΟΛΟΓΗ ΤΗΣ ΤΟΥ ΣΧΙΖΟΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ, ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ(ΠΕΡΙΚΟΠΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗΣ)

YEAST NUCLEAR RNA POLYMERASES ARE ORGANISED AROUND A CORE OF FOUR SUBUNITS RELATED TO THE BACTERIAL CORE ENZYME (ΒΒ'Α2), SHARE FIVE SUBUNITS AND CONTAIN SEVERAL ENZYME-SPECIFIC SUBUNITS. RPB8 IS ONE OF THE FIVE COMMON SUBUNITS (RPB5,RPB6, RPB8, RPB10Α, RPB10Β) ENCODED BY A SINGLE COPY GENE THAT IS ESSENTIAL FOR VIABILITY. THE STRUCTURAL AND FUCTIONAL CONSERVATION OF THE RPB8 HOMOLOGUE IN HUMAN AND THE ABSENCE OF SUCH A HOMOLOGUE IN ARCHAEL RNA POLYMERASE, CHARACTERIZES THE RPB8 SUBUNITS AS TYPICAL EUKARYOTIC AND IMPLIES ITS CENTRAL ROLE IN TRANSCRIPTION.HOWEVER THE PERCISE ROLE OF THA RPB8 SUBUNIT IN EUKARYOTIC TRANSCRIPTION IS STILL ELUSIVE.IN THE PRESENT WORK, THE SHIZOSACCHAROMYCES POMBE CDNA HOMOLOGOUS TO THE RPB8 GENE OF SACCHAROMYCES CEREVISIAEWAS ISOLATED AS A HIGH COPY SUPPERSSOR OF THE GCN2 MUTATION.THE RPB8 CDNA PREDICTS A PROTEIN SEQUENCE OF 125 AMINO ACIDS.ALIGNEMENT OF THE S.POMBE RPB8 AND S.CEREVISIAE RPB8 (146 RESIDUES)SUBUNIT SEQUENCES REVEALED AN EXTENSIVE AMOUNT OF SIMILARITY (42% IDENTICAL AND 60% SIMILAR AMINO ACIDS) BETWEEN THE TWO PROTEINS.DESPITE THIS SIMILARITY,THE S.POMBE RPB8 SUBUNIT WAS NOT ABLE TO COMPLEMENT THE LETHAL PHENOTYPE OF THE CORRESPONDING NULL ALLELE IN S.CEREVISIAE.IT WAS DEMONSTRATED THAT THE S.POMBE RPB8 SUBUNIT COMPETES THE ENDOGENOUS RPB8 SUBUNIT FOR ITS PROPER FUNCTION AND OVERCOMES THE GCN2 DEFECT BYINCREASING CONSTITUTIVELY THE TRANSLATION OF THE GCN4 MRNA. OVEREXPRESSIONOF THE RPB8 SUBUNIT ENHANCED FURTHER TRANSLATION OF THE GCN4MRNA AND RESULTED IN SLOW GROWTH AND COLD SENSITIVE PHENOTYPES IN GC