Υδρόθειο και ανόργανα νιτρικά: δράσεις και αλληλεπιδράσεις σε μεταβολικές παθήσεις

Abstract

Obesity and metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) are major sources of morbidity worldwide and have a high economic impact. Many studies have proposed therapeutic approaches about obesity and MASLD however the most of them appear side effects. In the last few years, Mediterranean diet has been proposed as an alternative intervention, reducing body weight and improve liver function. Nitric oxide (NO) and hydrogen sulfide (H2S) are recognized as gasotransmitters and are physiological regulators in a variety of mammalian cells and tissues. The two gaseous signalling molecules are endogenously synthesized by enzymes and obtained from diet. According to the current literature, NO and H2S exert a variety of effects that relate to adipose tissue and liver physiology. This thesis encompasses two main directions. The first part involves the study of the effect of natural products, that are rich in nitrates and hydrogen sulfide-species in the treatment of obesity. The second part investigates the role of endogenously produced H2S in MASLD. Here, we investigated the therapeutic effects of dietary nitrate and naturally occurring H2S donors, which is found in high levels in Beta vulgaris (B1-B9) and Eruca sativa (R1-R3) extracts, on obesity and liver steatosis. As far as MASLD study, we analyze the pathological phenotype of liver steatosis in Cth/Mpst knockout (Cth/Mpst -/-).Extracts from the different vegetables were screened for their ability to limit lipid accumulation in adipocytes and hepatocytes and for their ability to promote glucose uptake in skeletal muscle cultures; the most effective extracts were next tested in vivo. Wild type (WT) mice were randomly assigned to intervention groups and placed on high-fat diet (HFD) for 8 weeks to promote weight gain; animals receiving the selected B. vulgaris and E. sativa extracts exhibited attenuated body weight. Treatment with extracts also led to reduced white adipose tissue depot mass, attenuated adipocyte size, reduced expression of Dgat2 and PPARγ expression, and improved liver steatosis. In contrast, the extracts failed to improve glucose tolerance in obese animals and did not affect blood pressure. In the second part of study, WT and Cth/Mpst -/- male and female mice were used. In the liver section from young male mice were determined protein levels of H2S synthesizing and degrading enzymes. Young Cth/Mpst -/- mice, fed a normal diet, had increased liver mass caused by enhanced hepatic lipid accumulation. In addition, decreased insulin, glucose and pyruvate sensitivity was observed in CTH/MPST-deficient mice. In vitro experiment revealed that pharmacological inhibition of CTH and MPST enzymes induced lipid accumulation in hepatocytes and increased glucose uptake. The whole transcriptome analysis uncovered significant upregulation of cholesterol biosynthesis-related genes in liver of Cth/Mpst -/- mice. Sulfide donor (SG1002) treatment attenuated the fatty liver disease of CTH/MPST-deficient mice. Taken together, data from first section in our research, indicate that extracts produced from B. vulgaris and E. sativa exhibit antiobesity effects, suggesting that dietary supplements containing nitrates and sulfide releasing compounds might be useful in limiting weight gain. Additionally the second part of the research, underline the importance of endogenously produced H2S in the pathogenesis of MASLD and introduce the Cth/Mpst -/- mouse as a new animal model of early onset hepatic steatosis, which could be utilized for the identification of novel therapeutic targets and preclinical drug evaluation.

Η παχυσαρκία και η στεατική ηπατική νόσος που σχετίζεται με μεταβολική δυσλειτουργία (metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD) είναι δύο μη μεταδοτικές ασθένειες με υψηλό επιπολασμό παγκοσμίως και με σοβαρές επιπτώσεις στην υγεία. Μέχρι στιγμής έχουν προταθεί πολλές θεραπευτικές προσεγγίσεις τόσο για την παχυσαρκία όσο και για τη MASLD, ωστόσο οι περισσότερες εμφανίζουν ανεπιθύμητες ενέργειες. Για αυτό το λόγο η επιστημονική κοινότητα τα τελευταία χρόνια έχει στραφεί στη συνεισφορά των φυτικών εκχυλισμάτων για την αντιμετώπιση πολλών ασθενειών που σχετίζονται με το μεταβολισμό. Το υδρόθειο (H2S) και το μονοξείδιο του αζώτου (NO) ανήκουν στην κατηγορία των αέριων σηματοδοτικών μορίων, τα οποία συντίθενται ενδογενώς στον οργανισμό και προσλαμβάνονται διαμέσου της τροφής. Σύμφωνα με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, οι δύο αέριοι διαμεσολαβητές συμβάλλουν στην ομοιόσταση του οργανισμού ενώ παράλληλα τονίζεται η σημαντική τους δράση στη φυσιολογική λειτουργία του λιπώδους ιστού και του ήπατος. Η παρούσα μελέτη χωρίζεται σε δύο τμήματα. Στο πρώτο μέρος εξετάζεται η δράση φυτικών εκχυλισμάτων πλούσια σε νιτρικά ιόντα και ενώσεις υδρόθειου έναντι της παχυσαρκίας και στο δεύτερο τμήμα μελετάται η δράση του ενδογενούς παραγόμενου υδρόθειου στη MASLD. Σύμφωνα με τις επιδράσεις κάθε αέριου σηματοδοτικού μορίου στην παχυσαρκία σχεδιάστηκαν δύο μονοθεραπείες και μία συνδυαστική των δύο, αφού πρώτα έγινε διαλογή μεταξύ εννέα εκχυλισμάτων προερχόμενα από τεύτλα (B1-B9) και τρία από ρόκα (R1-R3). Όσον αφορά τη MASLD, εξετάστηκαν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της νόσου σε μύες με απαλοιφή δύο εκ των τριών ενζύμων παραγωγής του υδρόθειου.Τα εκχυλίσματα από τα τεύτλα και τη ρόκα μελετήθηκαν σε λιποκύτταρα, ηπατοκύτταρα και σκελετικά μυοκύτταρα. Με βάση τα πρώτα αποτελέσματα που προέκυψαν, επιλέχθηκαν τα αποτελεσματικότερα εκχυλίσματα, ένα από τα τεύτλα (B8) και ένα από τη ρόκα (R1) ώστε να εξεταστεί η πιθανή συνεργιστική τους δράση. Ακολούθως, τόσο μονομερώς όσο και συνδυαστικά εξετάστηκαν σε in vivo πειραματικό μοντέλο παχυσαρκίας. Αρσενικοί μύες C57BL/6J ταξινομήθηκαν τυχαία, έχοντας παρόμοιο σωματικό βάρος, σε τέσσερις ομάδες για τον έλεγχο της δράσης των εκχυλισμάτων στην παχυσαρκία. Συγκεκριμένα, για οχτώ εβδομάδες οι μύες κατανάλωναν δίαιτα υψηλή σε λιπαρά (45% λίπος, HFD) και τα εκχυλίσματα διαλυμένα σε νερό ημερησίως. Την έκτη εβδομάδα του πρωτοκόλλου ελέγχθηκε η αρτηριακή πίεση των μυών και την έβδομη εβδομάδα πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη. Στο τέλος του πρωτοκόλλου, καταγράφηκε το βάρος του λιπώδους ιστού και του ήπατος. Ακολούθησε ιστολογική ανάλυση και προσδιορισμός του μηχανισμού δράσης των εκχυλισμάτων στο λευκό υποδόριο ιστό. Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί και θηλυκοί μύες, αγρίου τύπου (WT) και διαγονιδιακοί με απαλοιφή των γονιδίων Cth και Mpst (Cth/Mpst -/-). Αρχικά, προσδιορίστηκε η πρωτεϊνική έκφραση των ενζύμων παραγωγής και καταβολισμού H2S σε ήπαρ νεαρών WT και Cth/Mpst -/- αρσενικών μυών. Ακολούθως, σε αρσενικούς και θηλυκούς μύες καταγράφηκε το βάρος του ήπατος και πραγματοποιήθηκε ηπατική ιστολογική ανάλυση για την επιβεβαίωση συσσώρευσης λιποσταγονιδίων. Για τον έλεγχο του μεταβολισμού, δοκιμασίες ανοχής στη γλυκόζη, την ινσουλίνη και του πυροσταφυλικού διεξήχθησαν μετά από νηστεία. Βάσει των πρώτων ενδείξεων για τη συσσώρευση λιποσταγονιδίων στο ήπαρ, εξετάστηκε σε in vitro μοντέλο η φαρμακολογική αναστολή των ενζύμων CTH και MPST μέσω προσδιορισμού των επιπέδων γλυκόζης στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων και της εναπόθεσης λίπους. Στη συνέχεια, προκειμένου να κατανοηθεί ο μηχανισμός δράσης της απαλοιφής των δύο γονιδίων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με αλληλούχιση RNA (RNA sequencing) σε ήπαρ αρσενικών μυών. Τέλος, χρησιμοποιώντας ένα δότη απελευθέρωσης υδρόθειου ελέγχθηκε η πιθανή αντιστροφή του παθολογικού φαινοτύπου μέσω της εξωγενούς χορήγησης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων του πρώτου τμήματος, ο συνδυασμός των εκχυλισμάτων Β8 και R1, προκάλεσε μείωση της λιπιδικής σύστασης των ηπατοκυττάρων και επιλέχθηκε για την in vivo μελέτη. Παρατηρήθηκε ότι τα Β8 και R1 τόσο μονομερώς όσο και σε συνδυασμό βελτίωσαν το σωματικό βάρος των παχύσαρκων μυών. Οι ιστολογικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι η μείωση της μάζας του λευκού λιπώδους ιστού οφείλεται στο μικρότερο μέγεθος των λιποκυττάρων και ότι ο μηχανισμός δράσης οφείλεται στην αυξημένη γονιδιακή έκφραση των Pparγ και Dgat2, δύο γονίδια υπεύθυνα για τη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων και τη σύνθεση τριγλυκεριδίων. Επιπλέον, η χορήγηση των εκχυλισμάτων έδειξε ότι βελτιώνει την ηπατική στεάτωση που προκαλείται λόγω έκτοπης εναπόθεσης λίπους στην παχυσαρκία ενώ δεν επηρεάστηκε ο μεταβολισμός της γλυκόζης και η αρτηριακή πίεση. Όσον αφορά την δεύτερη ενότητα της διατριβής για το χαρακτηρισμό των Cth/Mpst -/- μυών, αρχικά αποδείχτηκε ότι η απαλοιφή των δύο γονιδίων δεν επηρεάζει την πρωτεϊνική έκφραση των ενζύμων παραγωγής (CBS) και αποικοδόμησης (ETHE1, TST, SQRDL) H2S. Η μάζα του ήπατος των αρσενικών Cth/Mpst -/- μυών ήταν μεγαλύτερη συγκριτικά με τα WT και η ιστολογική ανάλυση υπέδειξε την ύπαρξη λιπώδους διήθησης στα ηπατοκύτταρα. Οι δοκιμασίες ανοχής στη γλυκόζη και την ινσουλίνη αποκάλυψαν τη διαταραχή του μεταβολισμού της γλυκόζης ενώ η δοκιμασία χορήγησης του άλατος πυροσταφυλικού απέδειξε την αυξημένη γλυκονεογένεση στο ήπαρ των Cth/Mpst -/- μυών. Επίσης, σε in vitro πειραματικό μοντέλο επιβεβαιώθηκε ότι η φαρμακολογική αναστολή των ενζύμων CTH και MPST επάγει τη συσσώρευση των λιποσταγονιδίων στα ηπατοκύτταρα και την πρόσληψη της γλυκόζης από το περιβάλλον της ανάπτυξης τους. Σύμφωνα με τα δεδομένα που προέκυψαν από το RNA sequencing, η αυξημένη εναπόθεση λίπους στο ήπαρ οφείλεται στη διαταραχή της ομοιόστασης της χοληστερόλης. Η εξωγενής χορήγηση του δότη υδρόθειου προκάλεσε αντιστροφή των συμπτωμάτων της ηπατικής στεάτωσης, με μείωση της μάζας του ήπατος, βελτίωση της συσσώρευσης λιποσταγονιδίων εντός των λιποκυττάρων και με τα μειωμένα επίπεδα της τρανσαμινάσης της αλανίνης (ALT), ένα βιοχημικό δείκτη ηπατικής βλάβης. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της μελέτης των εκχυλισμάτων σε διαταραχές του μεταβολισμού, υποστηρίζουν ότι τα εκχυλίσματα τεύτλων (B8) και ρόκας (R1) δρουν θεραπευτικά κατά της παχυσαρκίας βελτιώνοντας τις μεταβολικές λειτουργίες του λιπώδους ιστού και του ήπατος in vivo. H μελέτη μας παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για τις ευεργετικές δράσεις των πράσινων φυλλωδών λαχανικών που είναι πλούσια σε νιτρικά ιόντα και ενώσεις υδρόθειου με στόχο την αξιοποίηση των βιολογικών δράσεων τους στην κλινική πράξη. Παράλληλα, στο δεύτερο κομμάτι της ερευνητικής εργασίας προτείνεται ως πειραματικό μοντέλο της MASLD, μύες με απαλοιφή των γονιδίων Cth και Mpst, το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην ανακάλυψη νέων θεραπευτικών στόχων και για τον προκλινικό έλεγχο υποψήφιων φαρμάκων.