Διαταραχές του μεταβολισμού των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και τα αυτοάνοσα νοσήματα του ήπατος

Abstract

Branched chain amino acids (BCAAs), leucine, isoleucine and valine, are essential amino acids widely studied for their critical role in the regulation of protein synthesis (mTOR - mechanistic target of rapamycin - signaling pathway) and their emerging recognition as players in the regulation of energy metabolism, glucose homeostasis as well as normal function of immune system and brain. BCAA supplementation is primarily used as a beneficial nutritional intervention in chronic liver and kidney disease as well as muscle wasting disorders. However, the downregulated/upregulated levels of BCAAs in biological fluids and their defective catabolism in various tissues, mainly due to altered enzymatic activity of the first two enzymes in their catabolic pathway, BCAA aminotransferase (BCAT) and branched-chain a-keto acid dehydrogenase (BCKD), have been associated with many nutritional and disease states. The underlying mechanisms of impaired BCAA catabolism have been investigated in the pathogenesis of numerous pathological conditions such as inborn errors of metabolism, obesity and different types of diabetes, cardiovascular diseases, neurodegenerative disorders (Alzheimer's disease), cancer, kidney and liver disease. The recovery of the dysregulated BCAA catabolism may be associated with improved outcome and prevention of severe complications of the related disease. The aim of the present thesis was to investigate the pathophysiological/pathogenetic role of BCAAs and their catabolic intermediates, their possible prognostic and/or diagnostic value in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Gestational Diabetes Mellitus (GDM), Diabetic Nephropathy (DN) and Autoimmune Liver Diseases and treatment response. The study included 53 healthy controls, 50 patients with T2DM before and after treatment with dapagliflozin for 3 months, 22 patients with type 2 diabetes collected 3 years before the onset of DN, 62 women with GDM compared with 77 healthy pregnant women, 341 patients with Autoimmune Liver Diseases at diagnosis and after treatment and 101 patients with chronic viral hepatitis B and C. The metabolic profile of the biological fluids from the study groups was detected by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy on a Bruker Avance DRX NMR 500MHz spectrometer (NMR Center, University of Ioannina) and on an Avance III 700 MHz spectrometer (University of Patra). In order to improved detection and quantification of low abundant metabolites in NMR spectroscopy, macromolecules (proteins and lipoproteins) were eliminated from serum/plasma samples by ultrafiltration. BCAAs and metabolites related to their catabolism were then identified and quantified from the analysis of 1HNMR spectrum. Based on the results of this thesis we conclude that, T2DM is characterized by a disturbed BCAA catabolism with main features: 1) the elevated levels of the three BCAAs and the α-keto acid of isoleucine, 3-methyl-2-oxovalerate in serum and urine 2) the accumulation of the valine catabolic intermediate 3-hydroxyisobutyrate and the reduction of the leucine catabolic products 2-oxoisocaproate and 3-hydroxyisovalerate in serum and 3) the increased urine concentration of the catabolic intermediates of isoleucine, 2-hydroxy-3-methylvalerate, of leucine, N-isovaleroylglycine and valine, 2-hydroxyisovalerate. Alterations in the levels of the above metabolites indicate reduced activity of the two main enzymes of the catabolic pathways of BCAAs and could be used as early biomarkers of impaired insulin sensitivity and onset of diabetes mellitus. Treatment of diabetic patients with the sodium glucose co-transporters-2 (SGLT-2) inhibitor dapagliflozin was followed by: 1) the decreased renal reabsorption of the three BCAAs may contribute to the regression of proximal tubular hypertrophy and 2) the elevated excretion of the catabolic products 2-hydroxyisovalerate, 2-hydroxy-3-methylvalerate and 3-hydroxyisovalerate as well as the decreased excretion of the two toxic catabolic intermediates, 3-methyl-2-oxovalerate and N-isovaleroylglycine. These changes possibly reflect an improvement in BCAA metabolism and may contribute to the renoprotective properties of dapagliflozin. The main alterations observed in patients 3 years before the diagnosis of DN were 1) the downregulated levels of the three BCAAs and 3-methyl-2-oxovalerate in the serum and urine which indicate an increase in BCKD dehydrogenase enzyme activity 2) the decreased serum levels of glutamate and 3) the reduced renal excretion of the catabolic intermediates, 2-hydroxyisovalerate, 2-hydroxy-3-methylvalerate, N-isovaleroylglycine, succinate, alanine and ketone bodies. The above metabolites, which are statistically significantly increased in T2DM and then decline statistically significantly 3 years before the diagnosis of nephropathy and could be prognostic biomarkers of DN.In GDM, compared to normal pregnancy, no changes in the levels of the three BCAAs per se were detected but of their catabolic intermediates. More specifically: 1) increased concentration of the leucine catabolic product 3-hydroxyisovalerate which is associated with increased ketogenesis and may be due to impaired function of the enzyme methylcrotonyl-CoA carboxylase possibly due to biotin deficiency, 2) elevated levels of the intermediate of valine degradation pathway 3-hydroxyisobutyrate, which may contribute to the accumulation of toxic lipid intermediates in muscles and lead to insulin resistance and 3) decreased levels of the isoleucine α-keto acid, 3-methyl-2-oxovalerate. These findings provide evidence that BCAA catabolism was affected in GDM but otherwise than in T2DM.In Autoimmune Liver Diseases, BCAAs were found to be mainly reduced. The lead causes are the increased catabolic rate because they are used 1) as precursors in the gluconeogenesis pathway, 2) as alternative ketogenic substrates in ketone bodies production (upregulated levels of ketone bodies), 3) in energy production (increased intermediates of the citric acid cycle) as well as 4) in ammonia detoxification pathways (increased levels of glutamate). In Autoimmune Hepatitis (AIH), the levels of isoleucine and the corresponding a-keto acid were found to be at normal levels, compared to the other two cholestatic autoimmune liver diseases (PBC & PSC), indicating these metabolites as candidate markers for the differential diagnosis of autoimmune liver diseases. Administration of immunosuppressive therapy in AIH patients was associated with improvement in the impaired catabolism of valine and leucine (reduction of 2-hydroxyisovalerate and 3-hydroxyisovalerate levels towards normal) following the improvement of liver fibrosis and biotin levels. Administration of ursodeoxycholic acid (UDCA) to PBC patients did not restore the reduced isoleucine levels but they were further decreased, indicating a metabolic profile closer to cirrhosis. Finally, in patients with PSC, treatment with ursodeoxycholic acid was associated with a statistically significant increase in leucine levels toward normal and an improvement in hepatic lipid metabolism. In conclusion, the levels of BCAAs and of their catabolic intermediates could be used as biomarkers of health and disease in clinical routine.

Τα αμινοξέα διακλαδισμένης αλυσίδας (Branched Chain Amino Acids, BCAAs) λευκίνη, ισολευκίνη και βαλίνη ανήκουν στα απαραίτητα αμινοξέα και έχουν μελετηθεί εκτενώς για τον κρίσιμο ρόλο τους στη ρύθμιση της μυϊκής πρωτεϊνοσύνθεσης (σηματοδοτικό μονοπάτι mTOR - mechanistic target of rapamycin), του ενεργειακού μεταβολισμού, της ομοιόστασης της γλυκόζης καθώς και της φυσιολογικής λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος και του εγκεφάλου. Τα συμπληρώματα BCAAs χρησιμοποιούνται κυρίως ως μια ευεργετική διατροφική παρέμβαση στη χρόνια ηπατική και νεφρική νόσο καθώς και σε διαταραχές με απώλεια μυϊκής μάζας (σαρκοπενία). Ωστόσο, η μεταβολή των επιπέδων των BCAAs στα βιολογικά υγρά και η διαταραχή των καταβολικών οδών τους στους ιστούς, κυρίως λόγω των αλλαγών της δραστικότητας των δύο βασικών ενζύμων του καταβολισμού τους, της αμινοτρανσφεράσης διακλαδισμένης αλυσίδας (Branched-Chain Aminotransferase, BCAT) και της αφυδρογονάσης των α-κετοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (Branched-Chain α-Ketoacid Dehydrogenase, BCKD) έχουν συσχετιστεί με νοσολογικές καταστάσεις. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί της διαταραχής του καταβολισμού των BCAAs διερευνώνται στα εγγενή μεταβολικά νοσήματα, στην παχυσαρκία και στους διαφορετικούς τύπους διαβήτη, στη καρδιαγγειακή νόσος, σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις (Αλτσχάιμερ), στον καρκίνο και στη νεφρική και ηπατική νόσο. Η «αποκατάσταση» του καταβολισμού των BCAAs μπορεί να σχετίζεται με την καλύτερη έκβαση και την πρόληψη επιπλοκών της εκάστοτε νοσολογικής κατάστασης. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του παθοφυσιολογικού/ παθογενετικού ρόλου των BCAAs και των καταβολικών τους ενδιάμεσων και η πιθανή προγνωστική και/ή διαγνωστική τους αξία στο Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 (ΣΔΤ2), στο Σακχαρώδη Διαβήτη Κύησης (ΣΔΚ), στη Διαβητική Νεφροπάθεια (ΔΝ) και στα Αυτοάνοσα Νοσήματα του Ήπατος (ΑΝΗ), καθώς και η συσχέτισή τους με την ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπευτική αγωγή.Μελετήθηκαν 53 υγιή άτομα, 50 ασθενείς με ΣΔΤ2 πριν και 3 μήνες μετά τη χορήγηση δαπαγλιφλοζίνης, 22 ασθενείς που εμφάνισαν ΔΝ 3 χρόνια μετά τη συλλογή του δείγματος, 62 γυναίκες με ΣΔΚ συγκριτικά με 77 με φυσιολογική κύηση, 341 ασθενείς με ΑΝΗ πριν και μετά τη χορήγηση θεραπευτικής αγωγής και 101 ασθενείς με Χρόνιες Ιογενείς Ηπατίτιδες B και C. Στις ομάδες μελέτης έγινε καταγραφή του μεταβολικού προφίλ των βιολογικών υγρών με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (1ΗΝΜR) στο φασματογράφο 500 MHz Avance Bruker DRX στο κέντρο NMR του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων και στο φασματογράφο Avance ΙΙΙ 700 MHz του Πανεπιστημίου Πατρών. Για την καλύτερη διακριτική ικανότητα της φασματοσκοπίας NMR στα δείγματα ορού/πλάσματος απομακρύνθηκαν τα μακρομόρια (πρωτεΐνες, λιποπρωτεΐνες) με διήθηση υπό φυγοκέντρηση (υπερδιήθηση). Ακολούθησε ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση από το φάσμα NMR των BCAAs και των μεταβολιτών που σχετίζονται με τον καταβολισμό τους. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής μπορούμε να συμπεράνουμε τα ακόλουθα: Ο ΣΔΤ2 χαρακτηρίζεται από διαταραχή του καταβολισμού των BCAAs με κύρια χαρακτηριστικά: 1) τα αυξημένα επίπεδα των τριών BCAAs και του α-κετοξέος της ισολευκίνης 3-μεθυλο-2-οξο-βαλερικό οξύ στον ορό και στα ούρα 2) τη συσσώρευση του καταβολικού ενδιάμεσου της βαλίνης 3-υδροξυ-ισοβουτυρικό οξύ και τη μείωση των καταβολικών προϊόντων της λευκίνης 2-οξο-ισοκαπροϊκό οξύ και 3-υδροξυ-ισοβαλερικό οξύ στον ορό καθώς και 3) την αυξημένη απέκκριση των καταβολικών ενδιάμεσων της ισολευκίνης 2-υδροξυ-3-μεθυλο-βαλερικό οξύ, της λευκίνης Ν-ισοβαλεροϋλογλυκίνη και της βαλίνης 2-υδροξυ-ισοβαλερικό οξύ. Οι μεταβολές των συγκεντρώσεων των παραπάνω μεταβολιτών σχετίζονται με τη μειωμένη δραστικότητα των δύο βασικών ενζύμων των καταβολικών οδών των BCAAs και θα μπορούσαν να αποτελέσουν πρώιμους δείκτες μειωμένης ευαισθησίας στην ινσουλίνη και εμφάνισης σακχαρώδη διαβήτη. Η χορήγηση του αναστολέα του συμμεταφορέα νατρίου-γλυκόζης (δαπαγλιφλοζίνη) σε διαβητικούς ασθενείς συνδέθηκε 1) με την αυξημένη απέκκριση των τριών BCAAs γεγονός που υποδεικνύει ότι η επαγόμενη από τη δαπαγλιφλοζίνη μειωμένη επαναρρόφησή τους μπορεί να συμβάλλει στη μείωση της υπερτροφίας των εγγύς σωληναριακών νεφρικών κυττάρων, 2) με την αυξημένη συγκέντρωση στα ούρα των καταβολικών προϊόντων 2-υδροξυ-ισοβαλερικό οξύ, 2-υδροξυ-3-μεθυλο-βαλερικό οξύ και 3-υδροξυ-ισοβαλερικό οξύ καθώς και με τη μειωμένη απέκκριση των δύο τοξικών καταβολικών ενδιάμεσων, 3-μεθυλο-2-οξο-βαλερικό οξύ και Ν-ισοβαλεροϋλογλυκίνης. Τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν τη μερική αποκατάσταση της διαταραχής του καταβολισμού των BCAAs και σχετίζονται με τη νεφροπροστατευτική δράση του φαρμάκου. Στους ασθενείς 3 χρόνια πριν τη διάγνωση διαβητικής νεφροπάθειας ανιχνεύτηκαν 1) μειωμένα επίπεδα των τριών BCAAs και του 3-μεθυλο-2-οξο-βαλερικού οξέος στον ορό και στα ούρα τα οποία υποδεικνύουν αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας της αφυδρογονάσης BCKD 2) μειωμένα επίπεδα γλουταμινικού στον ορό και 3) μειωμένη απέκκριση των καταβολικών προϊόντων 2-υδροξυ-ισοβαλερικό οξύ, 2-υδροξυ-3-μεθυλο-βαλερικό οξύ, Ν-ισοβαλεροϋλογλυκίνης, του ηλεκτρικού οξέος (ενδιάμεσο του κύκλου του κιτρικού), της αλανίνης καθώς και των κετονοσωμάτων. Οι παραπάνω μεταβολίτες, οι οποίοι είναι στατιστικά σημαντικά αυξημένοι στο ΣΔΤ2, μειώνονται στατιστικά σημαντικά 3 χρόνια πριν τη διάγνωση νεφροπάθειας και θα μπορούσαν να αποτελέσουν προγνωστικούς δείκτες ΔΝ. Στο ΣΔΚ, συγκριτικά με τη φυσιολογική κύηση δεν εντοπίσαμε μεταβολές στα επίπεδα των τριών BCAAs αλλά των καταβολικών τους ενδιάμεσων και συγκεκριμένα: 1) αυξημένες συγκεντρώσεις 3-υδροξυ-ισοβαλερικού οξέος (καταβολισμός λευκίνης) που συνδέονται με αυξημένη κετογένεση καθώς και με τη μειωμένη δραστικότητα του ενζύμου μεθυλοκροτονυλ-CoA καρβοξυλάση πιθανώς λόγω έλλειψης βιοτίνης 2) αυξημένα επίπεδα 3-υδροξυ-ισοβουτυρικού οξέος (καταβολισμός βαλίνης) που συμβάλλουν στη συσσώρευση τοξικών καταβολικών ενδιάμεσων των λιπιδίων στους μύες και την εμφάνιση αντίστασης στην ινσουλίνη και 2) μειωμένη συγκέντρωση 3-μεθυλο-2-οξοβαλερικού οξέος (α-κετοξύ ισολευκίνης). Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν διαταραχή του καταβολισμού των BCAAs αλλά με διαφορετικό μηχανισμό συγκριτικά με το ΣΔΤ2. Στα αυτοάνοσα νοσήματα του ήπατος, τα BCAAs ανευρίσκονται κυρίως μειωμένα καθώς συμμετέχουν ως ενναλακτικά υποστρώματα στα μονοπάτια γλυκονεογένεσης, κετογένεσης (αυξημένα επίπεδα κετονοσωμάτων), στους μηχανισμούς παραγωγής ενέργειας (αυξημένα ενδιάμεσα του κύκλου του κιτρικού οξέος) καθώς και στην αποτοξίνωση από αμμωνία (αυξημένα επίπεδα γλουταμινικού). Συγκριτικά με τα δύο χολοστατικά αυτοάνοσα νοσήματα, στην αυτοάνοση ηπατίτιδα τα επίπεδα της ισολευκίνης και του αντίστοιχου α-κετοξέος της ήταν φυσιολογικά αναδεικνύοντας τους σε υποψήφιους δείκτες διαφορικής διάγνωσης των αυτοάνοσων νοσημάτων του ήπατος. Η χορήγηση ανοσοκαταστολής στην ΑΗ σχετίστηκε με την μερική αποκατάσταση της διαταραχής του καταβολισμού των άλλων δύο BCAAs, βαλίνης και λευκίνης (μείωση των επιπέδων του 2-υδροξυ-ισοβαλερικού οξέος και 3-υδροξυ-ισοβαλερικό οξέος προς τα φυσιολογικά), της ηπατικής ίνωσης και των επιπέδων βιοτίνης. Η χορήγηση ουρσοδεοξυχολικού οξέος σε ασθενείς με ΠΧΧ δεν αποκατέστησε τα μειωμένα επίπεδα ισολευκίνης αλλά μειώθηκαν περαιτέρω, υποδεικνύοντας ένα μεταβολικό προφίλ με πιθανή εξέλιξη την κίρρωση. Τέλος στους ασθενείς με ΠΣΧ, η θεραπεία με ουρσοδεοξυχολικό οξύ συνδέθηκε με τη στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων της λευκίνης προς τα φυσιολογικά και τη βελτίωση του ηπατικού μεταβολισμού των λιπιδίων. Συμπερασματικά, τα επίπεδα των BCAAs και των μεταβολιτών που σχετίζονται με τον καταβολισμό τους θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως ειδικοί βιοδείκτες νοσολογικών καταστάσεων στην καθ΄ημέρα κλινική πράξη.