Functional characterization of an LCK cysteine mutant

Abstract

Antigen-induced T-cell receptor phosphorylation is the first signaling event in T cells to activate adaptive immunity against invading pathogens and cancer cells. PTKs are key mediators in the generation of intracellular signals that culminate in the activation of T cells. LCK belongs to the SFKs and it is crucial during T-cell activation and T-cell development. Regulation of the enzymatic activity of LCK occurs via phosphorylation of two conserved tyrosine residues: phosphorylation of Y394 and the conformational opening of LCK are believed to activate the kinase, whereas Y505 phosphorylation is thought to generate a closed, inactive form of LCK. Recently, also conserved cysteine residues have gained the attention of many researchers because they are involved in the regulation of the activity of PTKs and therefore they can be targeted for the development of new specific PTK inhibitors. In the context of my PhD thesis, I analyzed the functional relevance of the cysteine residue 476 of LCK, which is highly conserved among PTKs. To study the function of C476 in LCK, I have generated LCK constructs carrying a cysteine to alanine mutation. An LCK C476A mutant was expressed in the LCK-deficient Jurkat T-cell variant (J.LCK) and the stability, activity and function of the mutant were evaluated. First, I have shown that C476 regulates the protein stability and subcellular localization of LCK. Additionally, J.LCK T cells reconstituted with LCK C476A showed a strongly reduced phosphorylation of the regulatory residues, Y394 and Y505. Furthermore, analysis of the kinase activity of LCK C476A showed that it is enzymatically inactive. On the basis of these data, as well as analysis of its conformational status, it appears that LCK C476A adopts a conformation that resembles the so called “primed” LCK conformation. In line with these data, it is clear that the ability of LCK C476A to reconstitute TCR-mediated signaling is drastically attenuated. Moreover, I have shown that overexpression of the co-chaperone CDC37 rescues the stability and partially the activity of the LCK C476A mutant. Taking advantage of well-established techniques in my group, I investigated whether C476 is a target of reversible oxidation (Sulfenylation). It appears that C476 is not a direct target of Sulfenylation. The results of my PhD thesis additionally show that the C476A substitution converts LCK into a temperature sensitive mutant. Analysis of LCK C476A at lower temperatures revealed that it has an enhanced activity and function. Collectively, it appears that C476 is a crucial residue involved in the regulation of LCK activity and function. In the future, more information regarding the involvement of phosphatases in the regulation of LCK C476A phosphorylation as well as the investigations of other types of C476 post-translational modifications affecting this residue will contribute to the elucidation of the mechanistic aitiology of the regulatory role of the C476 residue.

Η επαγόμενη από αντιγόνο φωσφορυλίωση υποδοχέα Τ-κυττάρων είναι το πρώτο σηματοδοτικό συμβάν στα Τ κύτταρα για την ενεργοποίηση της προσαρμοστικής ανοσίας έναντι εισβολέων παθογόνων και καρκινικών κυττάρων. Τα PTK είναι βασικοί μεσολαβητές στη δημιουργία ενδοκυτταρικών σημάτων που καταλήγουν στην ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. Το LCK ανήκει στα SFKs και είναι ζωτικής σημασίας κατά την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και την ανάπτυξη των Τ-κυττάρων. Η ρύθμιση της ενζυματικής δραστηριότητας της LCK λαμβάνει χώρα μέσω φωσφορυλίωσης δύο συντηρημένων υπολειμμάτων τυροσίνης: η φωσφορυλίωση του Y394 και το διαμορφωτικό άνοιγμα της LCK πιστεύεται ότι ενεργοποιούν την κινάση, ενώ η φωσφορυλίωση Y505 θεωρείται ότι δημιουργεί μια κλειστή, ανενεργή μορφή LCK. Πρόσφατα, επίσης διατηρημένα υπολείμματα κυστεΐνης έχουν κερδίσει την προσοχή πολλών ερευνητών επειδή εμπλέκονται στη ρύθμιση της δραστηριότητας των ΡΤΚ και ως εκ τούτου μπορούν να στοχευθούν στην ανάπτυξη νέων ειδικών αναστολέων ΡΤΚ. Στο πλαίσιο της διδακτορικής μου διατριβής, ανέλυσα τη λειτουργική συνάφεια του υπολείμματος κυστεΐνης 476 του LCK, το οποίο διατηρείται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των PTK. Για να μελετήσω τη λειτουργία του C476 στο LCK, έχω δημιουργήσει κατασκευές LCK που φέρουν μετάλλαξη κυστεΐνης σε αλανίνη. Ένα μετάλλαγμα LCK C476A εκφράστηκε στην παραλλαγή Τ-κυττάρου Jurkat με έλλειψη LCK (J.LCK) και αξιολογήθηκαν η σταθερότητα, η δραστικότητα και η λειτουργία του μεταλλάγματος. Πρώτον, έχω δείξει ότι το C476 ρυθμίζει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης και τον υποκυτταρικό εντοπισμό της LCK. Επιπροσθέτως, τα Τ κύτταρα J.LCK που ανασυστάθηκαν με LCK C476A έδειξαν ισχυρά μειωμένη φωσφορυλίωση των ρυθμιστικών υπολειμμάτων, Υ394 και Υ505. Επιπλέον, η ανάλυση της δραστικότητας κινάσης του LCK C476A έδειξε ότι είναι ενζυματικά ανενεργό. Με βάση αυτά τα δεδομένα, καθώς και την ανάλυση της διαμορφωτικής του κατάστασης, φαίνεται ότι το LCK C476A υιοθετεί μια διαμόρφωση που μοιάζει με τη λεγόμενη «primed» διαμόρφωση LCK. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, είναι σαφές ότι η ικανότητα του LCK C476A να ανασυνθέτει τη σηματοδότηση με τη μεσολάβηση TCR μειώνεται δραστικά. Επιπλέον, έχω έδειξε ότι η υπερέκφραση του συνοδηγού CDC37 διασώζει τη σταθερότητα και εν μέρει τη δραστηριότητα του μεταλλάγματος LCK C476A. Εκμεταλλευόμενος τις καθιερωμένες τεχνικές στην ομάδα μου, ερεύνησα εάν το C476 είναι στόχος αναστρέψιμης οξείδωσης (σουλφενυλίωση). Φαίνεται ότι το C476 δεν είναι άμεσος στόχος σουλφενυλίωσης. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής μου διατριβής δείχνουν επίσης ότι η υποκατάσταση C476A μετατρέπει το LCK σε ένα μεταλλαγμένο ευαίσθητο στη θερμοκρασία. Η ανάλυση του LCK C476A σε χαμηλότερες θερμοκρασίες αποκάλυψε ότι έχει ενισχυμένη δραστηριότητα και λειτουργία.Συλλογικά, φαίνεται ότι το C476 είναι ένα κρίσιμο υπόλειμμα που εμπλέκεται στη ρύθμιση της δραστηριότητας και της λειτουργίας του LCK. Στο μέλλον, περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη συμμετοχή των φωσφατάσης στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης LCK C476A καθώς και οι έρευνες άλλων τύπων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων του C476 που επηρεάζουν αυτό το υπόλειμμα θα συμβάλουν στην αποσαφήνιση της μηχανιστικής αιτιολογίας του ρυθμιστικού ρόλου του C476 υπόλειμμα.

Zur Bekämpfung eindringender Krankheitserreger und Tumorzellen wird die adaptive Immunantwort ausgelöst. Die Antigen-induzierte T-Zell-Rezeptor-Phosphorylierung ist das erste Signalisierungsereignis in T-Zellen zur Aktivierung dieser Immunantwort. Schlüsselmediatoren für die Aktivierung von T-Zellen sind Protein-Tyrosin-Kinasen, da sie intrazellulärer Signalkaskaden generieren. Die Protein-Tyrosine-Kinase LCK, aus der SRC-Kinase-Familie, ist essentiell für die T-Zell-Aktivierung und T-Zell-Entwicklung. Die Regulierung der enzymatischen Aktivität von LCK erfolgt hauptsächlich über die Phosphorylierung der zwei hochkonservierten Tyrosinresten, Y394 und Y505. Es wird angenommen, dass die Phosphorylierung von Y394 und die „Öffnung“ der LCK-Konformation die Kinase aktivieren, während die Phosphorylierung von Y505 zu einer geschlossenen, inaktiven Form von LCK führt. Weiterhin sind Cysteine an der Regulation der Protein-Tyrosin-Kinaseaktivität beteiligt. Diese konservierten Cysteinereste können Anwendung in der Entwicklung neuer spezifischer Protein-Tyrosin-Kinase-Inhibitoren finden und sind daher in jüngster Zeit in den Fokus der Forschung geraten. Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich die funktionelle Relevanz des Cysteinrestes 476 (C476) von LCK, der unter Protein-Tyrosine-Kinasen hochkonserviert ist, analysiert. Um die Funktion dieses Restes zu untersuchen, habe ich LCK-Konstrukte generiert, die eine Cystein-zu-Alanin-Mutation (C476A) tragen. Um die Stablität, Aktivität und Funktion der LCK-C476A-Mutante zu analysieren, wurde die Mutante in LCK-defizienten Jurkat-T-Zellen (J.LCK) exprimiert. Zunächst habe ich gezeigt, dass C476 die Proteinstabilität und die subzelluläre Lokalisation von LCK reguliert. Außerdem zeigten die mit LCK C476A rekonstituierten J.LCK-T-Zellen eine stark reduzierte Phosphorylierung der regulatorischen Reste Y394 und Y505. Des Weiteren zeigte die Analyse der Kinaseaktivität, dass LCK C476A enzymatisch inaktiv ist. Aufgrund dieser Daten, sowie Konformationsstudien, scheint LCK C476A eine Konformation anzunehmen, die der sogenannten “primed LCK“-Konformation ähnelt. Diese Daten stimmen mit der drastisch abgeschwächten Fähigkeit der LCK-C476A-Mutante überein, die T-Zell-Rezeptor-vermittelte Signalübertragung in LCK-defizienten Jurkat-T-Zellen (J.LCK) wiederherzustellen. Darüber hinaus habe ich gezeigt, dass die Überexpression des Ko-Chaperons CDC37 der Instabilität und Inaktivität der LCK-C476A-Mutante positiv entgegenwirkt. Mithilfe etablierter Techniken in meiner Gruppe untersuchte ich, ob C476 ein Ziel der reversiblen Oxidation (Sulfenylierung) ist, was nicht bestätigt werde konnte. Außerdem zeigten die Ergebnisse meiner Doktorarbeit, dass die Cystein-Alanin-Substitution an der Stelle 476, LCK in eine temperaturempfindliche Mutante umwandelt. Die Analyse von LCK C476A bei niedrigeren Temperaturen ergab eine verbesserte Aktivität und Funktion. Zusammengefasst scheint C476 ein Proteinrest zu sein, der entscheidend an der Regulation der LCK-Aktivität und -Funktion beteiligt ist. Zur Aufklärung des regulatorischen Wirkmechanismus hinter der C476 sind weitere Informationen und Daten notwendig. Zum Einen, den Einfluss von Phosphatasen auf den Phosphorylierungstatus der LCK C476A Mutante, aber auch der Einfluss anderer posttranslationaler Modifikationen an gleicher Stelle.