Interactions between the zoophytophagous predator Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) and the tomato plant and their importance in the control of Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) and other serious pests of tomato

Abstract

Tomato, Solanum lycopersicum L. (Solanaceae) is one of the most valuable cultivated crops worldwide. However, it is infested by several insect pests that reduce quantity and quality of the product. Recently, one of the most devastating insect pests of tomato, the South American pinworm Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) has caused serious damages and substantial increase in the tomato production cost, worldwide. Due to the shortcomings of its chemical control, biological control has been prioritized with positive results. Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) is a generalist predator and one of the major biological control agents of T. absoluta and other pests of tomato. In addition to this, recent studies have shown that its phytophagy can trigger defense responses in tomato plants against pests, such as two spotted spider mite Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) and T. absoluta. Knowledge on the plant defence induction effects on the expression of related genes offers important information in pest control because certain genes may be associated with the activation of the defence pathways and act locally or have a systemic effect. Furthermore, plant feeding by arthropods causes several changes in the metabolomic profile of the plant. Individual metabolites produced after defence induction may be used as sources of new insecticides. However, the gene expression levels and metabolite profiling have been little studied in plants punctured by mirid predators. Finally, information is given regarding the RNA interference, suppression or silencing (RNAi) technique which very recently showed positive results in the control of T. absoluta but its possible effect on a natural enemy of T. absoluta has not been examined.In the second chapter of presentstudy, the expression of genes governing Jasmonic Acid (JA) biosynthesis pathway activated by plant feeding of N. tenuisand the fluctuations in the levels of underlying metabolites have been studied. Fifteen 3rdinstar nymphs of N. tenuis were caged on each top and lower leaf of tomato plants for 4 d to induce plant defense; after this period the predators were removed. T. absoluta, oviposition preference, larval period, and pupal weight were significantly reduced in N. tenuis punctured plants. T. urticae adults exhibited a significantly higher escape tendency and reduced survival on punctured plants. Metabolomics indicated such observations revealing substantial differences between N. tenuis-punctured and unpunctured (control) plants. Metabolites directly associated with the activation of the JA defense pathway, such as the precursor α-linolenic acid, had increased concentrations. The expression of the defense-related genes PI-II, MYC2, VSP2, and HEL was increased in the top leaves whereas only VSP2 and MBP2 in the lower leaves; interestingly, in the middle (unpunctured) leaves VSP2, HEL, and MBP2 were also upregulated, indicating systemic signaling. Therefore, phytophagy of N. tenuis caused adverse effects on T. absoluta and T. urticae, whereas the multi-omics approach (phenomics, metabolomics, and genomics) offered valuable insights into the nature of the plant defense responses and provided useful evidence for future applications in integrated pest management. In the third chapter of this study, the density threshold of N. tenuis nymphs per plant for induction of defence on T. absoluta was searched together with the persistence of the plant defence effects. For this reason, 3, 6 or 10 nymphs were enclosed on each of the top and bottom leaf of young tomato plants for 4 days. The results showed that oviposition by T. absoluta females was significantly reduced only on the plants punctured by the highest N. tenuis density used. Our findings showed that plants punctured by the highest predator density were more repellent to T. absoluta for either period of 7 or 14 days after the removal of predators, compared to control plants. The systemic nature of the induced defences was also expressed in all periods post treatment. Those results provide valuable information in critical aspects for possible practical use of plant defence effects induced by N. tenuis on T. absoluta such as the average number of predators required per plant, systemic nature of the effects and the persistence of the effects induced. In the last chapter, the possible compatibility of dsRNA-mediated pest management of T. absoluta with its biological control agent N. tenuis was examined. In fact, RNAi-mediated insect pest management has recently shown promising results against T. absoluta,however its compatibility with the natural enemies of this pest has not been assessed. In particular, this study aimed to investigate whether dsRNA (dsTa-αCOP) designed to target the T. absoluta-αCOP gene could cause adverse effects to its major biocontrol agent, the predator, N. tenuis. Oral exposure of N. tenuis to dsRNA (dsNt-αCOP) designed to target N. tenuis-αCOP resulted in a 61%, 67% and 55% reduction in its transcript level in comparison to the sucrose, dsGFP and dsTa-αCOP treatments, respectively. In addition, significantly higher mortality of 57% was recorded in dsNt-αCOP-treated N. tenuis when compared to the sucrose (7%), dsGFP (10%) and dsTa-αCOP (10%) treatments. Similarly, oral exposure of T. absoluta to dsTa-αCOP resulted in 50% mortality. Moreover, the predation rate of ~33-39 Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) eggs by N. tenuis adult dramatically reduced to almost half in the surviving dsNt-αCOP-treated N. tenuis. This worst-case exposure scenario confirmed for the first time that the RNAi methodis functional in N. tenuis and that the risk of exposure through the oral route is possible. However, dsTa-αCOP did not cause lethal or sub-lethal effects to N. tenuis upon oral exposure. In the context of a biosafety risk assessment of RNAi-mediated insect management, investigating the effects on non-target organisms is essential in order to include this method as part of an integrated pest management strategy. Based on our laboratory assays, RNAi-mediated control is compatible with the biological control of T. absoluta by its natural enemy N. tenuis, adding the RNAi approach in the armoire of integrated pest management of T. absoluta. In conclusion,this Thesis focuses on advanced eco-friendly management of T. absoluta and T. urticae employing several innovative pest management techniques. Additionally indicates necessary bioassay methodologies and new approaches useful for the implementation of these new pest management strategies. Thus, the findings add knowledge to the upcoming IPM methodologies which can be implemented in near future in tomato crop.

Η καλλιέργεια της τομάτας, Solanum lycopersicum L. (Solanaceae) είναι μια από τις καλλιέργειες με τη μεγαλύτερη οικονομική σημασία παγκοσμίως. Ωστόσο, η τομάτα προσβάλλεται από διάφορα έντομα που μειώνουν την ποσότητα και την ποιότητα της παραγωγής. Πρόσφατα, ένα από τα πιο καταστρεπτικά έντομα της τομάτας, το Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) προκαλεί σοβαρές ζημιές και μεγάλη αύξηση στο κόστος παραγωγής. Η αντιμετώπισή του βασίζεται σε σημαντικό βαθμό και στη βιολογική αντιμετώπιση καθώς με τη χημική μέθοδο απαιτούνται επαναλαμβανόμενοι ψεκασμοί που μεταξύ άλλων, οδηγούν σε ανάπτυξη ανθεκτικότητας, αυξάνουν το κόστος και τον κίνδυνο υπολειμμάτων. Το Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) είναι ένα ζωοφυτοφάγο αρπακτικό, κύριος βιολογικός παράγοντας ελέγχου του T. absoluta και άλλων εντόμων-εχθρών της τομάτας. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η φυτοφαγία του μπορεί να προκαλέσει την επαγωγή της άμυνας του φυτού της τομάτας με σημαντικές αρνητικές επιδράσεις στο Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) και στο T. absoluta. Ωστόσο, η γνώση σχετικάμε τηνέκφραση γονιδίων άμυνας του φυτού ως αποτέλεσμα της φυτοφαγίας των αρπακτικών είναι πολύ περιορισμένη, αν και μπορεί να προσφέρει σημαντικές πληροφορίες στον έλεγχο των εντόμων-εχθρών, καθώς ορισμένα γονίδια που μπορεί να σχετίζονται με την ενεργοποίηση ορισμένων αμυντικών μονοπατιών να δρουν τοπικά ή να έχουν συστημική επίδραση, ενεργοποιώντας την άμυνα σε ολόκληρο το φυτό. Επιπλέον, η φυτοφαγία των αρπακτικών προκαλεί αλλαγές στο μεταβολικό προφίλ του φυτού ενώ μεμονωμένοι μεταβολίτες που παράγονται μετά από επαγωγή της άμυνας μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πηγές νέων εντομοκτόνων για την ενεργοποίηση της άμυνας του φυτού.Ωστόσο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και το μεταβολικό προφίλ έχουν πολύ λίγο μελετηθεί.Τέλος, δίνονται στοιχεία σχετικά με την τεχνική RNA παρέμβασης, καταστολής ή σίγασης (RNAi) η οποία πολύ πρόσφατα έδειξε θετικά αποτελέσματα στον έλεγχο του T. absoluta αλλά δεν έχει εξετασθεί η τυχόν επίδρασή της σε κάποιον φυσικό εχθρό του T. absoluta.Στο δεύτερος κεφάλαιο αυτής της διατριβής, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων που διέπουν το μονοπάτι βιοσύνθεσης του Ιασμονικού Οξέος (ΙΟ) που ενεργοποιείται από τη διατροφή του Ν. tenuis σε φυτά τομάτας και οι διακυμάνσεις στα επίπεδα των μεταβολιτών που προκαλούνται μετά την επαγωγή της άμυνας. Δεκαπέντε νύμφες 3ης ηλικίας του N. tenuis εγκλωβίστηκαν σε κάθε κορυφαίο και κατώτερο φύλλο φυτών τομάτας για 4 ημέρες για να προκληθεί η επαγωγή της άμυνας των φυτών. Μετά από αυτή την περίοδο τα αρπακτικά απομακρύνθηκαν. Όσον αφορά το T. absoluta, η προτίμηση ωοτοκίας, η διάρκεια ανάπτυξης της προνύμφης και το βάρος της νύμφης μειώθηκαν σημαντικά στα φυτά με N. tenuis σε σχέση με το μάρτυρα. Επίσης, τα ενήλικα T. urticae εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη τάση διαφυγής και μειωμένη επιβίωση σε σχέση με τα φυτά-μάρτυρες. Η μεταβολομική ανάλυση επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα αποκαλύπτοντας ουσιαστικές διαφορές μεταξύ των φυτών της επέμβασης και του μάρτυρα. Οι μεταβολίτες που σχετίζονται άμεσα με την ενεργοποίηση του μονοπατιού του ΙΟ, όπως η πρόδρομος ουσία α-λινολενικό οξύ, είχαν αυξημένες συγκεντρώσεις. Η έκφραση των σχετιζόμενων με την άμυνα γονιδίων PI-II, MYC2, VSP2 και HEL αυξήθηκε στα επάνω φύλλα ενώ τα VSP2 και MBP2μόνοστα κάτω φύλλα. Είναι ενδιαφέρον ότι στα μεσαία (μη εκτεθειμένα στο Ν. tenuis) φύλλα, ταVSP2, HEL και MBP2υπερεκφράστηκαν, υποδεικνύοντας συστημική ενεργοποίηση της άμυνας του φυτού. Συμπερασματικά, η φυτοφαγία του N. tenuis προκάλεσε δυσμενείς επιπτώσεις στην ωοτοκία και στην ανάπτυξη τουT. absoluta και στην επιβίωση και συμπεριφορά τουT. urticae, ενώ η ανάλυση των φαινομένων που σχετίζονται με την επαγωγή της άμυνας του φυτού μέσω της φαινολογίας, της γενομικής και της μεταβολομικής του (phenomics, genomics και metabolomics) πρόσφερε πολύτιμες γνώσεις για την κατανόηση της φύσης των αμυντικών αντιδράσεων των φυτών και παρείχε χρήσιμα στοιχεία για πιθανές μελλοντικέςεφαρμογές στην ολοκληρωμένη αντιμετώπιση των εντόμων-εχθρών των καλλιεργειών.Στο τρίτο κεφάλαιο αυτής της μελέτης, ερευνήθηκε το κατώτερο όριοπληθυσμιακής πυκνότητας νυμφών του N. tenuis ανά φυτό τομάταςπου απαιτείται για να επάγει την άμυνα του φυτού στο T. absolutaκαθώς και το διάστημαπου η άμυνα του φυτού παραμένει ικανή να προκαλεί αρνητικές επιδράσεις στο Τ. absoluta. Για το λόγο αυτό, 3, 6 ή 10 νύμφες του N. tenuis εγκλωβίστηκαν σε κάθε κορυφαίο και κατώτερο φύλλο νεαρών φυτών τομάτας με τρία φύλλα συνολικά, για 4 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ωοτοκία τουT. absoluta μειώθηκε σημαντικά μόνο στα φυτά που χρησιμοποιήθηκε η υψηλότερη πυκνότητα του N. tenuis. Περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι στα φυτά (με την υψηλότερη πυκνότητα αρπακτικών)τα θηλυκά τουT. absolutaεναπόθεσαν σημαντικά λιγότερα ωά σε σχέση με φυτά-μάρτυρες, 7 και 14 ημέρες μετά την απομάκρυνση των αρπακτικών. Η συστημική φύση τηςεπαγόμενηςάμυνας των φυτών επιβεβαιώθηκε επίσης σε όλες τις περιόδους καθώς και στο μεσαίο φύλλο υπήρχε μείωση της εναπόθεσης ωών όπως και στα νέα φύλλα που εκπτύχθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Αυτά τα αποτελέσματα προσφέρουν πολύτιμες πληροφορίες για την πιθανή πρακτική εφαρμογήτης μεθόδου στην αντιμετώπιση του Τ. absoluta σε κρίσιμες πτυχέςτης, όπως ο αριθμός των αρπακτικών που απαιτούνται ανά φυτό, η συστημική ενεργοποίηση και η διάρκεια διατήρησης των επιδράσεων που προκαλούνται. Στο τελευταίο κεφάλαιο της διατριβής, εξετάστηκε η πιθανή συμβατότητα της διαχείρισης του T. absolutaμε τη μέθοδο dsRNA με την παράλληλη χρήση του N. tenuis. Η διαχείριση εντόμων με τη μέθοδο RNAi έδειξε πρόσφατα υποσχόμενα αποτελέσματα και κατά του T. absoluta, ωστόσο η συμβατότητά της με τους φυσικούς εχθρούς του Τ. absoluta δεν έχει αξιολογηθεί. Συγκεκριμένα, αυτή η μελέτη είχε στόχο να διερευνήσει εάν το dsRNA (dsTa-αCOP) που σχεδιάστηκε για να στοχεύει το γονίδιο T. absoluta-αCOP θα μπορούσε να προκαλέσει δυσμενείς επιπτώσεις στον κύριο παράγοντα βιολογικού ελέγχου του, το αρπακτικό, N. tenuis. Η έκθεση του N. tenuisμέσω της στοματικής οδού σε dsRNA (dsNt-αCOP) που σχεδιάστηκε για να στοχεύει το N. tenuis-αCOP, είχε ως αποτέλεσμα 61%, 67% και 55% μείωση του επιπέδου μεταγραφής του σε σύγκριση με τις επεμβάσεις όπου χρησιμοποιήθηκε σακχαρόζη, dsGFP και dsTa-αCOP, αντίστοιχα. Επιπλέον, σημαντικά υψηλότερη θνησιμότητα 57% του N. tenuis καταγράφηκε στιςεπεμβάσειςμε dsNt-αCOP σε σύγκριση με σακχαρόζη (7%), dsGFP (10%) και dsTa-αCOP (10%). Επίσης, η ημερήσια αρπακτική ικανότητα(33-39 ωά)Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) ανά ενήλικοN. tenuis μειώθηκε δραματικά σχεδόν στο μισό σε άτομαN. tenuis που επέζησαν μετά την επέμβαση με dsNt-αCOP. Αυτά τα πειράματα έδειξαν για πρώτη φορά ότι ο μηχανισμός RNAi είναι λειτουργικός στο Ν. tenuis και ότι είναι δυνατός ο κίνδυνος έκθεσής του μέσω της στοματικής οδού. Αντίθετα, το dsTa-αCOP δεν προκάλεσε θανατηφόρα και υποθανατηφόρα αποτελέσματα στο N. tenuis κατά την από του στόματος έκθεση. Αντιθέτως, όπως αναμενόταν, η έκθεση του T. absoluta στο dsTa-αCOP είχε ως αποτέλεσμα 50% θνησιμότητα. Στο πλαίσιο της αξιολόγησης του κινδύνου βιοασφάλειας της διαχείρισης εντόμων με τη μέθοδο RNAi, η διερεύνηση των επιπτώσεων σε οργανισμούς μη-στόχους είναι απαραίτητη προκειμένου να συμπεριληφθεί αυτή η μέθοδος σε προγράμματα ολοκληρωμένης αντιμετώπισης. Με βάση τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας, ο έλεγχος με τη μέθοδο RNAi μπορεί να είναι συμβατός με το βιολογικό έλεγχο του T. absoluta από τον φυσικό εχθρό του N. tenuis, υποδεικνύοντας ότι η προσέγγιση RNAi θα μπορούσε να ενταχθεί σε στρατηγικές ολοκληρωμένης αντιμετώπισης του T. absoluta.Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή εστιάζει στην ανάπτυξη φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων διαχείρισηςτουT. absoluta και τουT. urticae χρησιμοποιώντας καινοτόμες τεχνικές και υποδεικνύει μεθοδολογίες βιοδοκιμών. Τα ευρήματα προσθέτουν χρήσιμη γνώση για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών διαχείρισης του T. absoluta καιτουT. urticae.