Engineered interfaces with polyelectrolyte multilayers, lipid bilayer membranes and virosomes for biomedical applications

Abstract

This thesis presents different approaches for the surface engineering by means of polyelectrolyte multilayers (PEMs), alone or in combination with lipid bilayers and influenza virosomes for biomedical applications. In chapter 1, PEMs of poly-L-lysine (PLL) and alginic acid sodium salt (Alg) are fabricated applying the layer by layer (LbL) technique and annealed at constant temperatures; 37, 50 and 80 °C, for 72 hours. Atomic force microscopy (AFM) reveals changes in the topography of the PEM, which is changing from a fibrillar to a smooth surface after annealing. Advancing contact angle in water varies from 36° before annealing to around 93°, 77° and 95° after annealing at 37, 50 and 80 °C respectively. Changes in surface energy after annealing were calculated from advancing and receding contact angle measurements performed with water and with organic solvents. Changes in the physical properties of the PEMs are interpreted as a result of the reorganization of the polyelectrolytes in the PEMs from a layered structure into complexes where the interaction of polycations and polyanions is enhanced. PEMs from biological origin have many potential applications in tissue engineering and regenerative medicine. However, the softness of biocompatible PEMs results in limited cell adhesion. Thermal annealing is suggested as a novel strategy for the enhancement of cellular adhesion on PEMs. The impact of thermal annealing at 37 °C, on the adhesion of human lung cancer A549 and myoblast C2C12 cell lines is studied. Cell adhesion, measured by the projected average cells spreading and focal contact is remarkably improved for the annealed PEMs. Quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D), contact angle and fluorescence spectroscopy measurements show a significant decrease in the adsorption of the bovine serum albumin protein to the PEMs after annealing. Our results provide a simple method to tune the wettability of bio-PEMs, improve cellular adhesion and endow them with antifouling characteristics.In chapter 2, the self-assembly of small unilamellar vesicles (SUVs) of mixed lipids zwitterionic phosphatidylcholine (DOPC, PC) and anionic phosphatidylserine (DOPS, PS) phospholipids on top of PEMs of poly(allylamine hydrochloride) (PAH), as a polycation, and poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS), as a polyanion, is investigated as a function of the composition of the assembled vesicles by means of QCM-D, cryo-transmission electron microscopy (CryoTEM), AFM and atomic force spectroscopy (AFS). Vesicles with molar percentages of PS between 50 % and 70 % result in the formation of a lipid bilayer on top of the PEMs. AFS studies performed with a PAH-modified cantilever approaching and retracting from the lipid assemblies reveal that the main interaction between PAH and the lipids takes place through hydrogen bonding between the amine groups of PAH and the carboxylate and phosphate groups of PS and with the phosphate groups of PC. The influence of the surface chemistry of PEMs on the formation of lipid bilayers is also studied for PEMs with poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDADMAC) as polycation and top layer, and PSS as polyanion. SUVs composed of DOPC and DOPS at 50:50 molar ratio are deposited on top of PEM films and studied via QCM-D and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). SUVs deposition on PDADMAC/PSS results in vesicles adsorption while on PAH/PSS under the same conditions a bilayer is formed. FRAP measurements confirm that SUVs are not ruptured on top of PDADMAC/PSS. The role of phosphate ions, in solution, on the formation of lipid bilayers is also analysed. Χ-ray photoelectron spectroscopy (XPS) shows the complexation of phosphate salts to the primary amines of PAH and no interaction with the quaternary amines of PDADMAC. ζ – potential measurements show a potential close to 0 mV for the PAH/PSS multilayers in PBS while PDADMAC/PSS display a potential of 38 mV. A model is presented for the formation of lipid bilayers on PAH/PSS PEMs taking into account the role of phosphate ions in decreasing electrostatic interactions between SUVs and PEMs and the formation of hydrogen bonding between the phospholipids and the primary amines of PAH.QCM-D and FRAP experiments show that when vesicles with a lipid composition of 50:50 DOPC:DOPS are adsorbed on PEMs where PSS is replaced by Alg or poly(acrylic acid) (PAA) the vesicle deposition does not result in a bilayer formation but in bilayer patches together with adsorbed intact vesicles. Therefore, the fusion of the lipid bilayer is not only affected by the last deposited layer that mainly interacts with the lipids but also by the overall composition of the PEM film. In chapter 3, SUVs prepared by a mixture of 30:70 DOPC:DOPS are assembled on top of a PEM cushion of PAH/PSS and the electrical properties of the bilayer are studied by electrochemical impedance spectroscopy (EIS). The bilayer supported on the PEMs shows a high resistance, in the order of 107 Ω cm2 which is indicative of a continuous, dense bilayer. Such resistance is comparable with the resistance of black lipid membranes, being the first time that these values are obtained for lipid bilayers supported on PEMs. The assembly of polyelectrolytes on top of a lipid bilayer decreases the resistance of the bilayer up to 2 orders of magnitude. Thus the assembly of the polyelectrolytes on the lipid bilayer induces defects or pores in the bilayer followed by a subsequent decrease in resistance.Finally, this thesis addresses, in Chapter 4, the fusion of immunostimulating reconstituted influenza virosomes (IRIVs) with the functional viral envelope glycoprotein, hemagglutinin (HA), to artificial supported lipid membranes assembled on PAH/PSS PEMs on both colloidal particles and planar substrates. R18 assay is used to prove the IRIVs fusion in dependence of pH, temperature and HA concentration. IRIVs display a pH-dependent fusion mechanism, fusing at low pH in analogy to the influenza virus. The pH dependent behaviour is confirmed by QCM-D. AFM imaging shows that at low pH virosomes are integrated in the supported membrane displaying flatered features and a reduced vertical thickness. IRIVs fusion offers a new strategy for transferring biological functions on artificial supported membranes with potential applications in targeted delivery and sensing.

Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει διαφορετικές προσεγγίσεις για την επιφανειακή μηχανική μέσω πολυστρωματικών πολυηλεκτρολυτών (PEM), μόνες ή σε συνδυασμό με λιπιδικές διπλές στοιβάδες και ιοσώματα γρίπης για βιοϊατρικές εφαρμογές.Στο κεφάλαιο 1, τα PEM της πολυ-L-λυσίνης (PLL) και του άλατος νατρίου αλγινικού οξέος (Alg) κατασκευάζονται με την εφαρμογή της τεχνικής στρώσης προς στρώμα (LbL) και ανόπτονται σε σταθερές θερμοκρασίες. 37, 50 και 80 °C, για 72 ώρες. Το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης (AFM) αποκαλύπτει αλλαγές στην τοπογραφία του PEM, το οποίο αλλάζει από ινώδη σε λεία επιφάνεια μετά την ανόπτηση. Η γωνία επαφής προώθησης στο νερό κυμαίνεται από 36° πριν από την ανόπτηση έως περίπου 93°, 77° και 95° μετά την ανόπτηση στους 37, 50 και 80°C αντίστοιχα. Οι αλλαγές στην επιφανειακή ενέργεια μετά την ανόπτηση υπολογίστηκαν από μετρήσεις γωνίας επαφής προώθησης και υποχώρησης που πραγματοποιήθηκαν με νερό και με οργανικούς διαλύτες. Οι αλλαγές στις φυσικές ιδιότητες των ΡΕΜ ερμηνεύονται ως αποτέλεσμα της αναδιοργάνωσης των πολυηλεκτρολυτών στα ΡΕΜ από μια πολυεπίπεδη δομή σε σύμπλοκα όπου ενισχύεται η αλληλεπίδραση πολυκατιόντων και πολυανιόντων. Τα PEM βιολογικής προέλευσης έχουν πολλές πιθανές εφαρμογές στη μηχανική ιστών και την αναγεννητική ιατρική. Ωστόσο, η απαλότητα των βιοσυμβατών PEM έχει ως αποτέλεσμα περιορισμένη κυτταρική προσκόλληση. Η θερμική ανόπτηση προτείνεται ως μια νέα στρατηγική για την ενίσχυση της κυτταρικής προσκόλλησης στα PEM. Μελετάται η επίδραση της θερμικής ανόπτησης στους 37 °C, στην προσκόλληση των κυτταρικών γραμμών του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα A549 και του μυοβλάστου C2C12. Η κυτταρική προσκόλληση, που μετράται από την προβαλλόμενη μέση εξάπλωση των κυττάρων και την εστιακή επαφή, είναι αξιοσημείωτα βελτιωμένη για τα ανοπτημένα PEM. Μικροϊσορροπία κρυστάλλων χαλαζία με διάχυση (QCM-D), γωνία επαφής και μετρήσεις φασματοσκοπίας φθορισμού δείχνουν σημαντική μείωση στην προσρόφηση της πρωτεΐνης λευκωματίνης ορού βοοειδών στα PEM μετά την ανόπτηση. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια απλή μέθοδο για τον συντονισμό της διαβρεξιμότητας των βιο-ΡΕΜ, τη βελτίωση της κυτταρικής πρόσφυσης και την παροχή αντιρρυπαντικών χαρακτηριστικών.Στο κεφάλαιο 2, η αυτοσυναρμολόγηση μικρών λιποσωμάτων (SUVs) μικτών λιπιδίων αμφιτεριονικής φωσφατιδυλοχολίνης (DOPC, PC) και ανιονικής φωσφατιδυλοσερίνης (DOPS, PS) φωσφολιπιδίων πάνω από PEM της υδροχλωρικής πολυ(αλλυλαμίνης), ως α (PAH) πολυκατιόν, και το πολυ(4-στυρενοσουλφονικό νάτριο) (PSS), ως πολυανιόν, διερευνάται ως συνάρτηση της σύνθεσης των συναρμολογημένων κυστιδίων μέσω QCM-D, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας κρυοδιαβίβασης (CryoTEM), AFM και ατομικής δύναμης φασματοσκοπία (AFS). Κυστίδια με μοριακά ποσοστά PS μεταξύ 50 % και 70 % έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας διπλοστοιβάδας λιπιδίων πάνω από τα PEM. Μελέτες AFS που πραγματοποιήθηκαν με πρόβολο τροποποιημένου με PAH που πλησιάζει και αποσύρεται από τα συγκροτήματα λιπιδίων αποκαλύπτουν ότι η κύρια αλληλεπίδραση μεταξύ PAH και λιπιδίων λαμβάνει χώρα μέσω δεσμών υδρογόνου μεταξύ των αμινών ομάδων του PAH και των καρβοξυλικών και φωσφορικών ομάδων του PS και με τις φωσφορικές ομάδες του Η/Υ.Η επίδραση της επιφανειακής χημείας των ΡΕΜ στο σχηματισμό λιπιδικών διπλών στοιβάδων μελετάται επίσης για ΡΕΜ με πολυ(χλωριούχο διαλλυλδιμεθυλαμμώνιο) (PDADMAC) ως πολυκατιόν και ανώτερο στρώμα και PSS ως πολυανιόν. Τα SUV που αποτελούνται από DOPC και DOPS σε μοριακή αναλογία 50:50 εναποτίθενται πάνω από φιλμ PEM και μελετώνται μέσω QCM-D και ανάκτησης φθορισμού μετά τη φωτολεύκανση (FRAP). Η εναπόθεση των SUV σε PDADMAC/PSS έχει ως αποτέλεσμα την προσρόφηση κυστιδίων ενώ σε PAH/PSS υπό τις ίδιες συνθήκες σχηματίζεται μια διπλή στιβάδα. Οι μετρήσεις FRAP επιβεβαιώνουν ότι τα SUV δεν έχουν υποστεί ρήξη πάνω από το PDADMAC/PSS. Αναλύεται επίσης ο ρόλος των φωσφορικών ιόντων, σε διάλυμα, στο σχηματισμό λιπιδικών διπλών στοιβάδων. Η φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίου ακτίνων Χ (XPS) δείχνει τη συμπλοκοποίηση των φωσφορικών αλάτων με τις πρωτοταγείς αμίνες του PAH και καμία αλληλεπίδραση με τις τεταρτοταγείς αμίνες του PDADMAC. Οι μετρήσεις δυναμικού (z-potential) δείχνουν δυναμικό κοντά στα 0 mV για τα πολυστρωματικά PAH/PSS στο PBS ενώ τα PDADMAC/PSS εμφανίζουν δυναμικό 38 mV. Παρουσιάζεται ένα μοντέλο για το σχηματισμό λιπιδικών διπλών στοιβάδων σε PAH/PSS PEM λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο των φωσφορικών ιόντων στη μείωση των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ SUV και PEM και τον σχηματισμό δεσμών υδρογόνου μεταξύ των φωσφολιπιδίων και των πρωτοταγών αμινών της PAH.Τα πειράματα QCM-D και FRAP δείχνουν ότι όταν κυστίδια με λιπιδική σύνθεση 50:50 DOPC:DOPS απορροφώνται σε PEM όπου το PSS αντικαθίσταται από Alg ή πολυ(ακρυλικό οξύ) (PAA), η εναπόθεση κυστιδίων δεν οδηγεί σε σχηματισμό διπλής στιβάδας αλλά σε επιθέματα διπλής στιβάδας μαζί με προσροφημένα άθικτα κυστίδια. Επομένως, η σύντηξη της διπλής στιβάδας λιπιδίων δεν επηρεάζεται μόνο από το τελευταίο στρώμα που εναποτίθεται που αλληλεπιδρά κυρίως με τα λιπίδια αλλά και από τη συνολική σύνθεση του φιλμ ΡΕΜ.Στο κεφάλαιο 3, τα SUV που παρασκευάζονται από ένα μείγμα DOPC:DOPS 30:70 συναρμολογούνται πάνω σε ένα μαξιλάρι PEM PAH/PSS και οι ηλεκτρικές ιδιότητες της διπλής στρώσης μελετώνται με φασματοσκοπία ηλεκτροχημικής αντίστασης (EIS). Η διπλή στρώση που υποστηρίζεται στα PEM παρουσιάζει υψηλή αντίσταση, της τάξης των 107 Ω cm2, η οποία είναι ενδεικτική μιας συνεχούς, πυκνής διπλής στρώσης. Αυτή η αντίσταση είναι συγκρίσιμη με την αντίσταση των μαύρων λιπιδικών μεμβρανών, καθώς είναι η πρώτη φορά που αυτές οι τιμές λαμβάνονται για διπλές στοιβάδες λιπιδίων που υποστηρίζονται σε PEM. Η συναρμολόγηση πολυηλεκτρολυτών πάνω από μια λιπιδική διπλοστοιβάδα μειώνει την αντίσταση της διπλής στιβάδας έως και 2 τάξεις μεγέθους. Έτσι η συναρμολόγηση των πολυηλεκτρολυτών στη λιπιδική διπλοστοιβάδα προκαλεί ελαττώματα ή πόρους στη διπλή στιβάδα που ακολουθείται από μια επακόλουθη μείωση της αντίστασης.Τέλος, αυτή η διατριβή πραγματεύεται, στο Κεφάλαιο 4, τη σύντηξη ανοσοδιεγερτικών ανασυσταθέντων ιοσωμάτων γρίπης (IRIVs) με τη λειτουργική γλυκοπρωτεΐνη ιικού φακέλου, αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ), σε τεχνητές υποστηριζόμενες λιπιδικές μεμβράνες που συναρμολογούνται σε PAH/PSS PEMs τόσο στα κολλοειδή όσο και στα υποστρώματα. . Ο προσδιορισμός R18 χρησιμοποιείται για να αποδείξει τη σύντηξη των IRIV σε εξάρτηση από το pH, τη θερμοκρασία και τη συγκέντρωση ΗΑ. Τα IRIV εμφανίζουν μηχανισμό σύντηξης που εξαρτάται από το pH, που συντήκεται σε χαμηλό pH σε αναλογία με τον ιό της γρίπης. Η συμπεριφορά που εξαρτάται από το pH επιβεβαιώνεται από το QCM-D. Η απεικόνιση AFM δείχνει ότι σε χαμηλό pH τα ιοσώματα είναι ενσωματωμένα στην υποστηριζόμενη μεμβράνη εμφανίζοντας κολακευμένα χαρακτηριστικά και μειωμένο κατακόρυφο πάχος. Η σύντηξη IRIVs προσφέρει μια νέα στρατηγική για τη μεταφορά βιολογικών λειτουργιών σε τεχνητές υποστηριζόμενες μεμβράνες με πιθανές εφαρμογές στη στοχευμένη παροχή και ανίχνευση.

Esta tesis presenta diferentes enfoques para la ingeniería de superficies mediante el uso de multicapas de polielectrolitos (PEMs) solas o en combinación con bicapas lipídicas y virosomas formados a partir del virus de la influenza para aplicaciones biomédicas.

En el capítulo 1, PEMs de poli-L-lisina (PLL) y alginato (Alg) se prepararon empleando la técnica de capa a capa del inglés ´´Layer by layer´´ (LbL). Las multicapas fueron sometidas a curado a temperaturas constantes de 37, 50 y 80 °C, durante 72 horas. La microscopía de fuerza atómica (AFM) revela cambios en la topografía de los PEMs, que se reorganizan a partir de una estructura fibrilar en una superficie homogénea y poco rugosa. El ángulo de contacto en agua varía de 36° antes del curado a 93°, 77° y 95° después de curar a 37, 50 y 80 °C, respectivamente. Los cambios de energía superficia después del curado, se calcularon a partir de medidas del ángulo de contacto en diferentes disolventes orgánicos. Los cambios en las propiedades físicas de la multicapa se interpretan como un resultado de la reorganización de los polielectrolitos en la multicapa; que pasa de una estructura laminar a una estructura formada por complejos donde se ve favorecida la interacción entre policationes y polianiones. Las multicapas de polielectrolitos biológicos tienen múltiples aplicaciones posibles en medicina regenerativa e Ingeniería del tejido. Sin embargo, el modulo elástico bajo de las PEMs biocompatibles resulta en una adhesión celular limitada. El curado térmico se presenta como una nueva estrategia para la mejora de la adhesión celular de las PEMs. De esta manera se estudia el impacto del curado a 37 °C de PLL/Alg sobre la adhesión de líneas celulares de células humanas de cáncer de pulmón A549 y mioblastos C2C12. La adhesión celular, medida por el promedio del área de las células que se extienden sobre la superficie estableciendo contacto focal con las superficies se ha mejorado notablemente para las PEMs después del curado. Se muestra mediante la microbalanza de cuarzo con disipación (QCM-D), medidas de ángulo de contacto y de fluorescencia que la adsorción de proteína albúmina de suero bovino (BSA) disminuye notablemente sobre las PEMs después del curado. Este trabajo propone un método sencillo para modificar el mojado superficial de las bio-PEMs, mejorar la adhesión celular y darles características de antiicrustante.

En el capítulo 2, el autoensamblado de vesículas de una mezcla de lípidos de fosfatidilcolina, un lípido zwitteriónico (DOPC, PC) y los fosfolípidos aniónicos de fosfatidilserina (DOPS, PS) sobre PEMs de hidrocloruro de poli(alilamina) (PAH), como policatión y sulfonato de poliestireno (PSS), como polianión, se investigó en función de la composición de vesículas mediante la QCM-D, microscopía electrónica de crio-transmisión (CryoTEM), AFM y espectroscopia de fuerza atómica (AFS). Vesículas con porcentajes molares de PS entre 50% y 70% resultan en la formación de una bicapa lipídica sobre las PEMs. Estudios de AFS con un cantilever modificado con PAH que se acerca y se retrae a los ensamblados de los lípidos, indican que la interacción principal entre PAH y los lípidos se lleva a cabo a través de enlace de hidrógeno entre los grupos aminos de PAH y los grupos de carboxilato y fosfato de la PS y con los grupos de fosfato de la PC. La influencia de la química superficial de la PEM en la formación de bicapas de lípidos se ha estudiado también con PEMs de cloruro de polidialildimetilamonio (PDADMAC) como capa superior policatiónica y PSS como polyanión. Vesiculas compuestas por DOPC y DOPS en relación molar de 50:50 se depositaron sobre PEMs de PDADMAC/PSS y se caracterizaron mediante QCM-D y fluorescencia recuperada después de fotoblanquear (FRAP). La deposición de vesículas sobre PDADMAC/PSS resulta en la adsorción de vesículas, mientras que sobre PAH/PSS en las mismas condiciones se forma una bicapa lipídica. Las medidas de FRAP confirman que las vesículas no se fusionan quedando adsorbidas sobre la superficie de la multicapa de PDADMAC/PSS. También se analiza la influencia de los iones de fosfato en solución, en la formación de una bicapa. Mediante la espectroscopia de fotoelectrones de rayos-Χ (XPS) se muestra la formación de complejos de sales de fosfato con las aminas primarias de PAH pero ninguna interacción con las aminas cuaternarias de PDADMAC. Medidas del potencial zeta muestran un potencial cerca a 0 mV para las multicapas de PAH/PSS en PBS mientras que para PDADMAC/PSS se observa un potencial de 38 mV. Se presenta un modelo para la formación de bicapas lipídicas soportadas en PAH/PSS teniendo en cuenta la influencia de los iones de fosfato que reducen las interacciones electrostáticas entre las SUVs y las PEMs y la formación de enlace de hidrógeno entre los fosfolípidos y las aminas primarias del PAH. Se realizaron experimentos de QCM-D y FRAP para demostrar la adsorción de vesículas de 50:50 PC:PS en cuando el PSS es reemplazada por Alg ó por poly(acido acrilico) (PAA). Se observó en estos casos la formación de parches de bicapas junto con vesículas adsorbidas sobre las PEMs. Por lo tanto, la formación de la bicapa lipídica no depende solamente de las características de la última capa de polielectrolito depositada, que interactúa principalmente con los lípidos, sino de la composición de la multicapa definida por el polianión en conjunto con el policatión.

En el capítulo 3, vesiculas formadas por una mezcla de 30:70 DOPC:DOPS fueron depositadas sobre una multicapa de PAH/PSS formando una bicapa y se estudiaron las propiedades eléctricas de la bicapa por medio de la espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). La bicapa en la PEM muestra una alta resistencia, en el orden de 107 cm2 Ω que es indicativo de una bicapa continua y densa. Tal resistencia es comparable con la resistencia de las membranas lipídicas negras, siendo la primera vez que estos valores se obtienen para bicapas de lípidos ensambladas en PEMs. El ensamblado de polielectrolitos encima de la bicapa de lípidos disminuye la resistencia de la bicapa hasta 2 órdenes de magnitud. El ensamblado sobre la bicapa lipídica induce defectos o poros en la bicapa, seguida por una posterior disminución en la resistencia.

Por último, en el capítulo 4, se presenta la fusión de virosomas inmunoestimulados reconstituidos a partir del virus de la gripe (IRIVs) conteniendo la glicoproteína de envoltura viral funcional, hemaglutinina (HA), a bicapas lipídicas artificiales ensambladas sobre multicapas de PAH/PSS soportadas en partículas coloidales y sustratos planos. El ensayo de R18 se utiliza para probar la fusión de los IRIVs en dependencia del pH, la temperatura y la concentración de HA. Los IRIVs muestran un mecanismo de fusión dependiente del pH, ya que se fusionan a pH bajo similar al virus de la gripe. El comportamiento dependiente del pH se confirma por medio de la QCM-D. Las imágenes obtenidas por AFM muestran que a pH bajo los virosomas están integrados en la membrana soportada exhibiendo las características de una estructura aplanada y un espesor vertical reducido. La fusión de los virosomas ofrece una nueva estrategia para la transferencia de funciones biológicas a membranas artificiales soportadas con aplicaciones potenciales en la liberación dirigida de medicamentos y en sensores biológicos.