Προγνωστική σημασία της παρουσίας μεταλλάξεων στα γονίδια IDH1, H3F3, ATRX, CIC, FUBP1 και TERT σε γλοιώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας

Abstract

Introduction: High grade glioma molecular profiling is of particular interest in neurooncology. The aim of this PhD thesis is to investigate the possibility of separating prognostic groups of patients with high grade gliomas based on mutation patterns in IDH1, H3F3, ATRX,CIC, FUBP1 and TERT genes.Methods:178 patients with a diagnosis of high-grade malignancy glioma were included in 2 cohorts. 126 patients were enrolled in cohort 1and a total of 101 paraffin blocks from these patients were analyzed. A further 52 new patients were enrolled in cohort 2 and these 52 new patients alongside 98 patients from cohort 1 from which paraffin blocks were available for further analysis consist cohort 2. Unfortunately in cohort 2 only 48 paraffin blocks were suitable for further analysis and from these 48 blocks at the end 32 were analysed. In cohort 1, tumor genotyping was performed with a 55 gene NGS panel. TERT mutations were tested with Sanger sequencing. MGMT promoter methylation status was determined by methylation specific PCR. In cohort 2 a broad pan cancer 80 gene NGS panel was used for tumor genotyping. 14 of 32 tumor specimens were also genotyped using the 55 gene NGS panel for diagnostic accuracy validation and clinical utility of the extended panel.Results:Cohort 1. 270 mutations were detected in 92/101 tumors (91.1%). TERT was the most frequently mutated gene (74.3%). IDH1/2 mutations were mutually exclusive with mutations in the neurofibromin 1 (NF1) gene. Mutated TERT was associated with wild-type (wt) IDH1/2 (p = 0.025). The 12-month overall survival (OS) rate was 74.3%. Patients with TERT and NF1 wt had a median OS of 40.8 months, while among pts with NF1 wt/TERT mutant, the median OS was 18.5 months. NF1 and TERT mutations univariately conferred shorter OS (HR = 3.19; p = 0.004 and HR = 2.28; p = 0.002). Upon multivariate analysis, mutated TERT showed marginal unfavorable prognostic significance for OS (p = 0.049), while NF1 lost its unfavorable significance (p = 0.151). Cohort 2. In total, 129 genetic alterations including 33 structural variants were identified in 38 distinct genes. Among 96 variants, 38 were pathogenic and 58 variants of unknown clinical significance (VUS). TP53 was the most frequently mutated gene, followed by PTEN and IDH1genes. Glioma patients with IDH1 mutant tumors were younger and had significantly longer overall survival compared to patients with wild-type IDH1tumors. Similarly, tumors with TP53mutations were more likely observed in younger glioma patients. Implementation of the comprehensive 80 gene and the55 gene panels resulted in the identification of 37 and 15 variants, respectively. Of those, 13 were common. Comprehensive 80 gene panel identified 24 additional variants, 22 of which located in regions that were not targeted by the 55 gene panel. On the contrary, the latter panel identified two additional variants.Conclusions: TERT is herein proven to confer poor prognosis in high grade gliomas, independent of IDH and MGMT mutations. NF1 seems to also confer poor prognosis although our small numbers do not allow for firm conclusions. Overall, our data show that using an extended tumor profile assay rather than a glioma-specific tumor profile panel identifies additional genetic changes that may be taken into consideration as potential therapeutic targets for glioma diagnosis and molecular classification.

Εισαγωγή: Το μοριακό προφίλ των γλοιωμάτων υψηλού βαθμού κακοήθειας παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη νεύρο-ογκολογία. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της δυνατότητας διαχωρισμού προγνωστικών ομάδων ασθενών με υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα με βάση τα πρότυπα των μεταλλάξεων στα γονίδια IDH1, H3F3, ATRX, CIC, FUBP1 και TERT. Στην παρούσα μελέτη συμπεριλήφθηκαν συνολικά 178 ασθενείς με διάγνωση γλοιώματος υψηλού βαθμού κακοήθειας βαθμού 3 και 4. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης συμπεριλήφθηκαν 126 ασθενείς και αναλύθηκαν συνολικά 101 κύβοι παραφίνης. Αυτοί οι ασθενείς αποτελούν την Ομάδα μελέτης 1. Στο δεύτερο στάδιο της μελέτης εντάχθησαν 52 νέοι ασθενείς που μαζί με 98 ασθενείς της Ομάδας μελέτης 1 αποτέλεσαν την ομάδα μελέτης 2. Στον πληθυσμό αυτό υπήρχε μεγάλο ποσοστό μη καταλληλότητας των δειγμάτων για περαιτέρω ανάλυση με NGS ώστε τελικά αναλύθηκαν 32 μόνο όγκοι.Μέθοδοι: Για την Ομάδα μελέτης 1, πραγματοποιήθηκε γονοτυπική ανάλυση των όγκων με ένα ειδικά σχεδιασμένο στο ΕΜΟ πάνελ NGS (πάνελ-55), το οποίο στοχεύει γενετικές παραλλαγές σε 55 γονίδια. Οι μεταλλάξεις στον υποκινητή του γονιδίου TERT εξετάστηκαν με αλληλούχηση κατά Sanger. Η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου MGMT προσδιορίστηκε με ειδική για τη μεθυλίωση PCR. Για την Ομάδα μελέτης 2, η γονοτυπική ανάλυση των όγκων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα παν-καρκινικό, εμπορικά διαθέσιμο πάνελ NGS (πάνελ-80) το οποίο στοχεύει γενετικές παραλλαγές σε 80 γονίδια καθώς και δομικές αλλαγές. Επιπλέον, οι 14 από τους 32 όγκους της Ομάδας μελέτης 2 υπεβλήθησαν σε γονοτυπική ανάλυση και με τα δύο πάνελ που επέτρεψε τον έλεγχο της διαγνωστικής ακρίβειας των δύο μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν. Αποτελέσματα:Ομάδα μελέτης 1Ανιχνεύθηκαν 270 μεταλλάξεις σε 92 από τους 101 όγκους (91,1%). Οι μεταλλάξεις στον υποκινητή του γονιδίου TERT ήταν οι πιο συχνές μεταλλάξεις στον πληθυσμό (74,3%) TERT συσχετίστηκαν με την απουσία μετάλλαξης στα γονίδια IDH1/2 (p=0,025). Οι μεταλλάξεις IDH1/2 ήταν αμοιβαία αποκλειόμενες με μεταλλάξεις NF1. Το ποσοστό ολικής επιβίωσης (OS) στους 12 μήνες ήταν 74,3% (OS: 22 μήνες). Οι ασθενείς με χωρίς μεταλλάξεις στα γονίδια TERT και NF1 είχαν καλύτερη ολική επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς που είχαν μετάλλαξη στον όγκο τους σε ένα από τα δύο γονίδια. Οι μεταλλάξεις NF1 και TERT μονοπαραγοντικά σχετίστηκαν με μικρότερη ολική επιβίωση (HR=3,19; p=0,004 και HR=2,28; p=0,002). Κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση, η παρουσία μετάλλαξης στο γονίδιο TERT διατήρησε οριακά την δυσμενή προγνωστική της σημασία για την ολική επιβίωση (p=0,049), ενώ η παρουσία μετάλλαξης στο γονίδιο NF1 έχασε τη δυσμενή σημασία του (p= 0,151). Ομάδα μελέτης 2Συνολικά, εντοπίστηκαν 129 γενετικές παραλλαγές, συμπεριλαμβανομένων 33 δομικών αλλαγών. Μεταξύ 96 μεταλλάξεων (SNVs και InDels), οι 38 ήταν παθογόνες και 58 ήταν παραλλαγές αγνώστου κλινικής σημασίας (VUS). Οι πιο συχνές μεταλλάξεις αφορούσαν τα γονίδια TP53, PTEN και IDH1. Οι ασθενείς με γλοίωμα με IDH1 μεταλλαγμένους όγκους ήταν νεότεροι και είχαν σημαντικά μεγαλύτερη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς τις εν λόγω μεταλλάξεις. Ομοίως, όγκοι με μεταλλάξεις του TP53 ήταν πιο πιθανό να παρατηρηθούν σε νεότερης ηλικίας ασθενείς. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε επίσης σύγκριση του προφίλ των μεταλλάξεων των δειγμάτων που αναλύθηκαν από τις δύο ομάδες ασθενών. Η διενέργεια NGS σε 14 κοινά δείγματα με το πάνελ-55 και το πάνελ-80 είχε ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό 37 και 15 παραλλαγών, αντίστοιχα. Από αυτές, οι 13 ήταν κοινές. Το πάνελ-80 ανίχνευσε 24 επιπρόσθετες μεταλλάξεις, 22 από τις οποίες εντοπίστηκαν σε περιοχές που δεν στοχεύονταν από το πάνελ-55. Αντιστρόφως, το πάνελ -55 εντόπισε δύο επιπρόσθετες μεταλλάξεις.Συμπεράσματα: Η παρουσία μετάλλαξης στο γονίδιο της TERT αποδεικνύεται στην παρούσα μελέτη ότι προσδίδει κακή πρόγνωση στα γλοιώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας, ανεξάρτητα από την παρουσία ή όχι μεταλλάξεων στα γονίδια IDH και MGMT. Το γονίδιο NF1 φαίνεται επίσης να προσδίδει κακή πρόγνωση, αν και ο μικρός αριθμός των ασθενών μας δεν επιτρέπει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Συνολικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η χρήση μιας διευρυμένης δοκιμασίας-πάνελ ανάλυσης του προφίλ του όγκου αντί ενός πάνελ που έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύει συγκεκριμένες γενετικές παραλλαγές που απαντώνται στα γλοιώματα επιτρέπει τον εντοπισμό πρόσθετων γενετικών αλλαγών, οι οποίες μπορούν να ληφθούν υπόψη ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι για τη διάγνωση και τη μοριακή ταξινόμηση του γλοιώματος.