Μελέτη λειτουργικότητας αιμοπεταλίων με τη μέθοδο PFA (Platelet Function Assay) σε νεογνά μητέρων με σακχαρώδη διαβήτη κύησης

Abstract

Introduction: Neonatal hemostasis has been the object of several studies throughout the last decades, and it has been elucidated as a developmental phenomenon that gradually matures and consists of a dynamic balance between pro- and anti- thrombotic factors that form a unique functional hemostatic model. Concerning neonatal primary hemostasis, it has been demonstrated that platelets are intrinsically hyporeactive during the first days of life, reaching the same levels of functionality as adult ones by day 14. However, neonatal hemostasis remains fully functional and efficient since this hyporeactivity seems to be counterbalanced by other plasma factors like increased hematocrits and higher levels of VWF multimers, hence no hemorrhagic events are observed in a healthy neonatal population. Several in vitro methods have been used to evaluate the efficiency of neonatal primary hemostasis, with some of the most recent ones being thromboelastography, Cone and Platelet Analyzer (CPA) and PFA-100 system. PFA-100 is a point of care, quick and reproducible test that examines platelet function and offers a quantitative measurement of the sequence of platelet adhesion, activation and aggregation under near- physiologic conditions of high shear stress. Closure Times (CTs) after utilization of 2 different reagents COL/EPI and COL/ADP are typically measured and the results of several studies so far have corroborated the existing conviction that neonatal primary hemostasis is fully functional compared to adult primary hemostasis, despite the innate neonatal platelet hypo-functionality, since neonatal CTs are shorter in neonates than in adults. Disorders of primary hemostasis represent a major problem for neonatal intensive care units, especially in neonates with other coexisting factors that influence the functionality of their platelets and lead to hemorrhagic events or rarely to thromboses. Conditions that have been corelated with primary hemostasis disorders include preeclampsia and hypertensive disease of pregnancy, smoking, autoimmune diseases and gestational diabetes melitus (GDM), all of which are categorized as high-risk pregnancies. GDM refers to the state of hyperglycemia during the second half of pregnancy, with no pre-existing diagnosis of diabetes mellitus, based on the results of an OGTT. It is characterized by insulin resistance that physiologically exists in uncomplicated pregnancies but is exaggerated in the case of GDM and it may be attributed to an excessive production of pro-inflammatory molecules by the placenta. These pro-inflammatory circulating hormones and cytokines, including TNFa, IL-6 and adipokines (resistin and leptin) form the basis of a low-grade inflammatory profile for GDM pregnancies and have been linked to a more prothrombotic state. GDM-complicated have been linked to adverse outcomes, both maternal and fetal such as preeclampsia, preterm birth for the mother and macrosomia due to hyperinsulinism, increased risk for trauma at birth, hypoglycemia, hypocalcemia, jaundice, respiratory distress and an increased risk of congenital malformations for the fetus. Maternal platelets in GDM show a propensity towards a more hyperresponsive phenotype as demonstrated by the elevated maternal MPVs, which appears to be multifactorial with several factors like insulin overproduction, oxidative stress and impaired calcium homeostasis playing an important role. While GDM’s impact on maternal platelet function has been established by several studies, scarce data exist in the literature on the effects of the associated glyco-metabolic changes in neonatal platelet function. Objective: The aim of this study is to primarily investigate, via the PFA-100 system, the platelet function of neonates born to mothers with GDM and to compare their CTs to these of neonates born from uncomplicated pregnancies. The secondary aims of the study were to obtain correlations of CTs with several perinatal parameters. Materials and methods: The study comprised two distinct groups, the study group (GDM group) which consisted of neonates born to mothers with GDM according to the ADA’s criteria and the control group which consisted of neonates from uncomplicated pregnancies. Umbilical cord blood samples were drawn for each neonate and all samples were tested with both COL/EPI and COL/ADP cartridges of PFA-100 in order to obtain two CTs for each neonate. The demographic data and perinatal parameters of the study population, such as the type of conception, delivery method, gestational age (GA), birth weight, gender, Apgar score, maternal medication during pregnancy (aspirin-ASA, low molecular weight heparins (LMWH), T4 (Thyroxine), peripartum administration of pethidine, epidural/general anesthesia, administration of ampicillin and diabetes medication) and neonatal blood group were recorded. Laboratory data from both the mother (Hct, MPV and platelets) and the neonate (white blood cells, WBCs’ red blood cells, RBCs; neonatal hemoglobin, Hb; Hct; platelets; MPV; VWF activity) were also measured. Results: In total, 202 samples were measured from the neonates, 84 from mothers with GDM and 118 from the controls. The comparison between the two groups in terms of the various categoric and arithmetic parameters that were measured showed that prematurity, aspirin administration and IVF pregnancy were more frequently observed in the GDM group, while percentile and Agar score were found to be lower in the study group compared to the control group. The primary aim of the study was to compare COL/EPI and COL/ADP CTs between the two groups and the result of that was a statistically significant finding only in the case of COL/EPI CTs that were longer in the GDM group than in the control group. Also, COL/ADP CTs were longer in neonates of the study group that were born via CS compared to the ones that were delivered vaginally as well as in neonates with blood group O compared to the ones with non-O blood type. Finally, negative correlations were found between COL/ADP CTs in the GDM group and parameters like GA, leukocyte count and VWF activity. Conclusions: In the present study, a relatively hyporeactive platelet phenotype was demonstrated in neonates born to mothers with GDM, as reflected by the prolonged COL/EPI CTs compared to the control group. This phenomenon could be attributed to several different factors that have been proven to influence primary hemostasis, such as hyperinsulinism and transient hypoglycemia and hypocalcemia that are frequently observed in this specific high risk pregnancy group. However, the most important finding is the absence of hemorrhagic complications in both the control and the study group. The discrepancy between the two groups in terms of platelet reactivity does not seem to induce an increased risk for bleeding, since both COL/EPI and COL/ADP CTs fall within the normal range for the neonatal population, as recently published by our research group, where a large homogeneous population of healthy term and preterm neonates was evaluated with PFA-100. PFA-100 is a system that serves to predict hematological disorders and closely monitor neonates that are at high risk for bleeding complications and requires no more than a small cord-blood sample, which is usually readily available. Thus, when measuring CTs via PFA-100 in neonates from high-risk pregnancies (such as GDM, preeclampsia, IUGR), any prolongation may warrant the need for closer observation to prevent or manage appropriately any hemorrhagic events that could compromise the prognosis or even increase mortality.

Η νεογνική αιμόσταση αποτελεί ένα αντικείμενο μελέτης που έχει διερευνηθεί σε βάθος τα τελευταία χρόνια οδηγώντας σε ορισμένα συμπεράσματα όσον αφορά τα μοναδικά χαρακτηριστικά της που τη διαφοροποιούν από το μοντέλο της πρωτογενούς αιμόστασης των ενηλίκων. Φαίνεται πως πρόκειται για ένα σύστημα δυναμικής ισορροπίας μεταξύ προπηκτικών και αντιπηκτικών παραγόντων το οποίο εδραιώνει την αντίληψη του μοντέλου της αναπτυξιακής αιμόστασης κατά το οποίο τα αιμοπετάλια των νεογνών εμφανίζονται υποαντιδραστικά στη γέννηση και σταδιακά ωριμάζουν έως τη 14η ημέρα ζωής. Παρά τη σχετική ενδογενή υποαντιδραστικότητα των νεογνικών αιμοπεταλίων, η οποία μάλιστα είναι εντονότερη όσο πιο πρόωρο είναι το νεογνό, η νεογνική πρωτογενής αιμόσταση παραμένει λειτουργική και φυσιολογική στο σύνολό της καθώς δεν παρατηρούνται φαινόμενα αιμορραγικής διάθεσης σε υγιή νεογνά. Στοιχεία του νεογνικούπλάσματος όπως οι αυξημένοι αιματοκρίτες και τα μεγαλύτερα πολυμερή του VWF σε σχέση με τα αντίστοιχα των ενηλίκων συμβάλλουν καθοριστικά στην αντιστάθμιση αυτής της υποαντιδραστικότητας, ενισχύοντας έτσι την πρωτογενή αιμόσταση η οποία είναι ακόμη πιο αποτελεσματική στα νεογνά από ότι στους ενήλικες. Έχουν χρησιμοποιηθεί κατά καιρούς διάφορες μέθοδοι για την αξιολόγηση της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων στα νεογνά, με κάποιους παλαιότερους όπως είναι ο χρόνος ροής, οι μελέτες συσσώρευσης των αιμοπεταλίων και η κυτταρομετρία ροής και ορισμένες πιο πρόσφατες όπως η θρομβοελαστογραφία, η ELISA, o Cone and Platelet Analyzer (CPA) και το σύστημα PFA-100. Το τελευταίο είναι μία point of care, γρήγορη και με επαναληψιμότητα μέθοδος in vitro αξιολόγησης της πρωτογενούς αιμόστασης που προσφέρει ποσοτική μέτρηση της προσκόλλησης, της ενεργοποίησης και της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων κάτω από συνθήκες όμοιες με τις φυσιολογικές και δεν επηρεάζεται καθόλου από το λοιπό καταρράκτη της πήξης. Επομένως το σύστημα αυτό εμφανίζει ορισμένα σαφή πλεονεκτήματα έναντι των υπολοίπων ιδίως λόγω του μικρού όγκου αίματος που απαιτείται και της ταχείας παροχής αποτελεσμάτων που διαφωτίζουν σε σχέση με τη λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων στον παιδιατρικό και δη στο νεογνικό πληθυσμό. Το γεγονός ότι η νεογνική αιμόσταση είναι καθόλα φυσιολογική έως και ενισχυμένη σε σχέση με των ενηλίκων παρά την ενδογενή υπο-αντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων κατά τις πρώτες 10 ημέρες ζωής, επιβεβαιώνεται και από τις μετρήσεις των χρόνων σύγκλεισης (CTs) που προκύπτουν με τη χρήση των 2 διαφορετικών αντιδραστηρίων του PFA-100, των COL-EPI και COL-ADP οι οποίοι είναι μικρότεροι από αυτούς των ενηλίκων. Οι διαταραχές της αιμόστασης αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα των νεογνών που νοσηλεύονται σε μονάδες εντατικής θεραπείας, ιδίως λόγω της συνύπαρξης άλλων παραγόντων που δυνητικά μπορούν να επηρεάσουν τη λειτουργία ή και τον αριθμό των αιμοπεταλίων ή να διαταράξουν τη δυναμική ισορροπία μεταξύ των προπηκτικών και αντιπηκτικών συστημάτων του νεογνικού οργανισμού οδηγώντας έτσι σε ανεπιθύμητες επιπλοκές όπως η αιμορραγία ή σπανιότερα η θρόμβωση. Καταστάσεις που σχετίζονται με διαταραχές της αιμόστασης είναι η προεκλαμψία, η υπέρταση κύησης, το κάπνισμα, αυτοάνοσα νοσήματα της μητέρας, διάφορες επίκτητες και συγγενείς μορφές θρομβοπενίας και ο σακχαρώδης διαβήτης (είτε ως προϋπάρχων είτε ως ΣΔΚ), που γι’ αυτόν καθώς και για άλλους λόγους χαρακτηρίζονται ως κυήσεις υψηλού κινδύνου. Όσον αφορά το ΣΔΚ, έχει μελετηθεί διεξοδικά η επίδρασή του στα αιμοπετάλια της μητέρας, όμως ελάχιστα έχει διερευνηθεί το αντίκτυπο που μπορεί να έχει στη νεογνική πλευρά της πρωτογενούς αιμόστασης ποιοτικά ή και ποσοτικά. Ο ΣΔΚ, δηλαδή η διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη που εμφανίζεται κατά το 2ο ή 3ο τρίμηνο της κύησης χωρίς να προϋπάρχει και διαγιγνώσκεται με τη διενέργεια OGTT κατά την 24η-28η εβδομάδα κύησης, χαρακτηρίζεται από υπέρμετρη μητρική παραγωγή γλυκόζης και αντίσταση στην ινσουλίνη που με τη σειρά τους επιφέρουν εμβρυική υπεργλυκαιμία και υπερινσουλινισμό. Συνέπεια αυτών είναι μία πληθώρα επιπλοκών που μπορεί να προκύψουν στα πλαίσια του ΣΔΚ και αφορούν το έμβρυο, μεταξύ των οποίων είναι και η προωρότητα, η μακροσωμία, το μαιευτικό τραύμα, οι συγγενείς ανωμαλίες, η υπογλυκαιμία, η υπασβεστιαιμία, το ΣΑΔ, η πολυκυτταραιμία και οι θρομβώσεις και μακροπρόθεσμα η παχυσαρκία και ο ΣΔ. Παθοφυσιολογικά ο ΣΔΚ αποτελεί μία κατάσταση διαταραγμένου προφίλ κυτοκινών με τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως οι IL-1, Il-6 και TNF-a καθώς και ορμόνες όπως η ρεζιστίνη και η λεπτίνη να επικρατούν παραγόμενες από τον πλακούντα και να εδραιώνουν ένα μοντέλο χαμηλού βαθμού φλεγμονής καθ΄ όλη τη διάρκεια της κύησης το οποίο εκτός από την αντίσταση στην ινσουλίνη, φαίνεται να συνδέεται άρρηκτα και με το προθρομβωτικό προφίλ των κυήσεων αυτών. Στο ΣΔΚ φαίνεται πως υπάρχει μία ενδογενήςυπεραντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων όπως καταμαρτυρούν οι αυξημένοι MPVs των διαβητικών εγκύων που λειτουργούν ως δείκτες ενός βιολογικά πιο ενεργού φαινοτύπου αιμοπεταλίων και έχουν συσχετιστεί παράλληλα με υψηλότερα επίπεδα αντίστασης στην ινσουλίνη κατά την κύηση. Η υπεραντιδραστικότητα αυτή όμως είναι ένα πολυπαραγοντικό φαινόμενο με διάφορους παράγοντες όπως το οξειδωτικό στρες, την υπερπαραγωγή ινσουλίνης και τη διαταραγμένη ομοιόσταση ασβεστίου να παίζουν σημαντικό ρόλο. Παρότι στις μητέρες με ΣΔΚ έχει εντοπιστεί αυτό το διακριτό μοτίβο υπεραντιδραστικότητας των αιμοπεταλίων, ελάχιστα δεδομένα υπάρχουν σχετικά με την επίδραση των αλλαγών του μεταβολισμού της γλυκόζης στη λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων των νεογνών αυτών των κυήσεων υψηλού κινδύνου. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση μέσω του συστήματος PFA-100 της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων στο αίμα ομφαλίου λώρου νεογνών μητέρων με ΣΔΚ και η σύγκριση των χρόνων σύγκλεισης που προκύπτουν με αυτό το σύστημα μεταξύ των νεογνών μητέρων με ΣΔΚ και νεογνών ανεπίπλεκτων κυήσεων. Δευτερεύων σκοπός της μελέτης είναι η συσχέτιση των χρόνων σύγκλεισης με διάφορες περιγεννητικές παραμέτρους. Ασθενείς και μέθοδος: Στη μελέτη συμπεριελήφθησαν νεογνά που κατηγοριοποιήθηκαν σε 2 ομάδες, την ομάδα μελέτης (ομάδα ΣΔΚ) και την ομάδα μαρτύρων (ομάδα control). Στην ομάδα μελέτης- ΣΔΚκατατάχθηκαν νεογνά των οποίων η μητέρα κατά την κύηση πληρούσε τα κριτήρια για τη διάγνωση του ΣΔΚ όπως αυτά έχουν οριστεί από την ADA, μέσω διενέργειας δοκιμασίας ανοχής στη γλυκόζη, ενώ η ομάδα μαρτύρων απαρτιζόταν από νεογνά προερχόμενα από ανεπίπλεκτες κυήσεις. Ελήφθησαν δείγματα ομφαλίου λώρου από όλα τα νεογνά και των δύο ομάδων προς επεξεργασία με τον αναλυτή PFA-100 (με βάση τις τεχνικές οδηγίες του κατασκευαστή), λαμβάνοντας δύο μετρήσεις CTs για κάθε δείγμα με καθένα από τα δύο αντιδραστήρια COL/EPI και COL/ADP, καθώς και ανάλυση των αιματολογικών παραμέτρων που αντιστοιχούν στο νεογνό μέσω της γενικής αίματος. Μετρήθηκαν επίσης οι εξής μεταβλητές ως δημογραφικά και κλινικο-εργαστηριακά χαρακτηριστικά του πληθυσμού της μελέτης: φύλο, ΗΚ- προωρότητα, είδος σύλληψης, είδοςτοκετού, πρόκληση τοκετού, Apgar Score 1'/ 5', ΒΓ, ΕΘ, θερμοκρασία (oC), νεογνική ομάδα αίματος, ασπιρίνη, ΗΧΜΒ, Τ4, πεθιδίνη, αναισθησία (επισκληρίδιος ή γενική), αμπικιλλίνη περί τον τοκετό, θεραπεία ΣΔΚ (δίαιτα, αντιδιαβητικά δισκία, ινσουλίνη), λευκοκύτταρα/ ερυθροκύτταρα/αιμοσφαιρίνη/ αιματοκρίτης/ αιμοπετάλια/ MPV/ δραστικότητα VWF σε νεογνά και μητέρες. Αποτελέσματα: Στο σύνολό τους συλλέχθηκαν 202 δείγματα από νεογνά, 84 εκ των οποίων ανήκαν στην ομάδα μελέτης- ΣΔΚ και τα υπόλοιπα 118 στην ομάδα μαρτύρων. Από τη σύγκριση μεταξύ των δύοομάδων, μελέτης και μαρτύρων, ως προς τις διάφορες κατηγορικές και αριθμητικές μεταβλητές που μελετήθηκαν προέκυψε πως η προωρότητα και η IVF κύηση ήταν συχνότερες στο ΣΔΚ σεστατιστικά σημαντικό επίπεδο, καθώς και η ΕΘ και το Apgar score στο 1ο λεπτό που ήταν χαμηλότερα και η χορήγηση ασπιρίνης που ήταν συχνότερη στο γκρουπ μελέτης συγκριτικά με τογκρουπ των μαρτύρων. Ο πρωταρχικός στόχος της μελέτης που αφορούσε σύγκριση των τιμών των COL/EPI και COL/ADP CTs μεταξύ της ομάδας μελέτης και της ομάδας μαρτύρων, έδειξε ότι το COL/EPI CT ήταν μεγαλύτερο στο γκρουπ του ΣΔΚ σε σχέση με των μαρτύρων (p=0.0075), χωρίς να υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων ως προς το COL/ADP CT. Επίσης, οι COL/ADP CTs ήταν μεγαλύτεροι στα νεογνά της ομάδας του ΣΔΚ που είχαν γεννηθεί με ΚΤ έναντι αυτών που είχαν γεννηθεί με ΦΤ καθώς και σε εκείνα που είχαν ομάδα αίματος Ο έναντι όσων είχαν άλλες ομάδες αίματος. Τέλος, αρνητικές συσχετίσεις εντοπίστηκαν ανάμεσα στους COL/ADP CTs στο γκρουπ ΣΔΚ και την ΗΚ των νεογνών καθώς και με τον αριθμό των νεογνικών λευκοκυττάρων καθώς και τη δραστικότητα VWF των νεογνών. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αναδεικνύουν έναν σχετικά υποαντιδραστικό φαινότυπο των νεογνικών αιμοπεταλίων ή πιο συγκεκριμένα των αιμοπεταλίων του αίματος του ομφαλίου λώρου, με βάση τους παρατεταμένους COL/EPI CTs που βρέθηκαν στην ομάδα ΣΔΚ σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να αποδοθεί σε διάφορους παράγοντες που αποδεδειγμένα επηρεάζουν το σύστημα της πρωτογενούς αιμόστασης όπως είναι ουπερινσουλινισμός και η παροδική υπογλυκαιμία και υπασβεστιαιμία που εμφανίζει αυτή η ομάδα νεογνών. Το σημαντικότερο όμως στοιχείο της μελέτης είναι πως τόσο στην ομάδα των 126 ανεπίπλεκτων κυήσεων όσο και στην ομάδα κυήσεων υψηλού κινδύνου με ΣΔΚ όπου φάνηκε να είναι διαφορετική η αιμοπεταλιακή λειτουργικότητα των αιμοπεταλίων, δεν παρουσιάστηκαν αιμορραγικά συμβάματα και άρα η όποια αιμοπεταλιακή υπο-αντιδραστικότητα δεν επέφερε αιμορραγική διάθεση. Οι χρόνοι σύγκλεισης που μετρήθηκαν στην πλειοψηφία των νεογνών βρίσκονταν εντός του εύρους τιμών που έχουν καθοριστεί ως φυσιολογικές για τον εν λόγω πληθυσμό από πρόσφατες μελέτες, επομένως αιτιολογείται η απουσία αιμορραγικής διάθεσης. Το εν λόγω σύστημα παρακολούθησης της πρωτογενούς αιμόστασης μέσω του PFA-100 που παρουσιάζει πολλαπλά πλεονεκτήματα στη χρήση του στην κλινική πράξη κι έτσι θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο στην ανίχνευση των νεογνών εκείνων σε μονάδες εντατικής θεραπείας που λόγω και άλλων παραγόντων κινδύνου όπως η προωρότητα μπορεί να εμφανίσουν αιμορραγική διάθεση, ώστε να αντιμετωπιστούν εγκαίρως και να έχουν το βέλτιστο follow-up.