Σύνθεση και μελέτη πεπτιδικών ανάλογων του φυσικού ανθρώπινου πεπτιδίου granulysin για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων

Abstract

In recent years, the urgent need for new generation antimicrobial agents, due to the reckless use of antibiotics, turned the researchers’ attention to new therapeutic agents, cationic antimicrobial peptides (AMPs). These peptides are already present in living microorganisms and they are part of the natural immune system. They show a broad spectrum of activity, as they possess antimicrobial activity against bacteria (gram-negative and gram-positive), fungi, protozoa, viruses, and parasites. They also possess anticancer activity, can be used for wound healing and act as mediators for the immune system. Cationic antimicrobial peptides (AMPs), also known as natural antibiotics, are short-length peptides, 10 to 50 amino acids, with low molecular weight and they have a positive charge. They consist of 50% hydrophilic and 50% hydrophobic amino acids and can be folded into amphipathic conformations when being in contact with cell membrane. This facilitates the rupture of the membranes of pathogenic microbes. In addition, AMPs must possess proteolytic stability and low hemolytic activity. To date, many antimicrobial peptides have been isolated and characterized. In the present study, twelve cationic peptide analogs of the natural human protein Granulysin were synthesized in order to develop new antibiotics. The sequences of the synthesized peptide analogs are as follows, with the 1st and 7th sequences corresponding to sections 5-16 and 23-34 of the natural protein, respectively: 1A1FR: Arg5-Tyr-Cys7(Acm)-Leu8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys16-NH2, 1A1AC: Ac-Arg-Tyr-Cys(Acm)-Leu-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 2A1FR: Arg-Tyr-Cys(Acm)-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 2A1AC: Ac-Arg-Tyr-Cys(Acm)-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 3A1FR: Arg-Tyr-Leu7-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 3A1AC: Ac-Arg-Tyr-Leu7-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 1A2FR: Gln23-Arg-Ser-Val-Ser-Asn28-Ala-Ala-Tyr31-Arg-Val-Cys34(Acm)-NH2, 1A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 2A2FR: Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 2A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 3A2FR: Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Lys31-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2 and 3A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Lys31-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2. Synthesis was performed by the stepwise solid-phase synthesis procedure, using the Fmoc/tBu method. The peptides were purified by semi-preparative and preparative RP-HPLC. The purity of peptides has been tested by analytical RP-HPLC. Peptides were identified by ESI-MS. The conformational characteristics of the peptide models were evaluated by circular dichroism spectroscopy (CD). The above peptides were tested for their antimicrobial activity against three Gram-negative bacteria, two Gram-positive bacteria and a fungus, while experiments were performed to study their cytotoxic activity against the cancer cell line A-549, by the MTT method. The peptides were also tested for their hemolytic activity. The experiments for the synthesis, identification and purification of the peptides were performed in the laboratory of Peptide chemistry, Department of Chemistry of the University of Ioannina, while the antimicrobial study and hemolytic activity took place in the laboratory of Biochemistry. The study of anti-cancer activity was performed in the Unit of Technical Infrastructures and Methods of Characterization and Control of Bioactivity of Substances. The experiments for the study of the secondary structure took place in the laboratory of Biochemistry, Medical School of the University of Ioannina. The results showed moderate activity against Gram (-) bacteria, fungus, and cancer cells A-549, while no action against Gram (+) bacteria. Peptides didn’t cause hemolysis. Α-helix percentages were low. Peptide 3A1FR is the one that stood out, having the highest percentages of α-helix and the best action (MIC Gram (-) bacteria = 200 μg/ml), MIC fungus = 100 μg/ml, IC50 cancer cells A-549 = 130 μg/ml) while at the respective concentrations the hemolysis levels were almost zero (EC => 500 μg/ml).

Τα τελευταία χρόνια η επιτακτική ανάγκη για μια νέα γενιά αντιμικροβιακών μέσων, λόγω της αλόγιστης χρήσης των αντιβιοτικών, έχει οδηγήσει την προσοχή των ερευνητών σε μια νέα κατηγορία αντιμικροβιακών μέσων, τα κατιονικά αντιμικροβιακά πεπτίδια (AMPs). Τα πεπτίδια αυτά υπάρχουν ήδη μέσα σε ζωντανούς μικροοργανισμούς και αποτελούν τμήμα της φυσικής ανοσίας. Το φάσμα δράσης τους είναι ευρύ, αφού μπορούν να αντιμετωπίσουν ιούς, βακτήρια (gram-αρνητικά και gram-θετικά), μύκητες, πρωτόζωα αλλά και παράσιτα. Επίσης, έχουν αντικαρκινική δράση, συμβάλλουν στην επούλωση τραυμάτων και λειτουργούν ως μεσολαβητές για το ανοσοποιητικό σύστημα. Τα AMPs, που χαρακτηρίζονται και ως φυσικά αντιβιοτικά, είναι πεπτίδια μικρού μήκους, από 10 έως 50 αμινοξέα, μικρού μοριακού βάρους και φέρουν θετικό φορτίο. Αποτελούνται από 50% υδρόφιλα και 50 % υδρόφοβα αμινοξέα και όταν έρθουν σε επαφή με κυτταρικές μεμβράνες αναδιπλώνονται σε αμφιπαθητικές διαμορφώσεις. Με αυτόν τον τρόπο διευκολύνεται η διάρρηξη των μεμβρανών των παθογόνων μικροβίων. Επιπλέον τα ΑΜPs πρέπει να έχουν πρωτεολυτική σταθερότητα και χαμηλή αιμολυτική δραστικότητα. Μέχρι σήμερα έχει απομονωθεί και χαρακτηριστεί ένας μεγάλος αριθμός αντιμικροβιακών πεπτιδίων. Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν δώδεκα κατιονικά πεπτιδικά ανάλογα της φυσικής ανθρώπινης πρωτεΐνης Granulysin με σκοπό την ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών. Οι αλληλουχίες των συντιθέμενων πεπτιδικών αναλόγων είναι οι ακόλουθες, με την 1η και 7η να αντιστοιχούν στα τμήματα 5-16 και 23-34 της φυσικής πρωτεΐνης, αντίστοιχα: 1A1FR: Arg5-Tyr-Cys7(Acm)-Leu8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys16-NH2, 1A1AC: Ac-Arg-Tyr-Cys(Acm)-Leu-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 2A1FR: Arg-Tyr-Cys(Acm)-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 2A1AC: Ac-Arg-Tyr-Cys(Acm)-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 3A1FR: Arg-Tyr-Leu7-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 3A1AC: Ac-Arg-Tyr-Leu7-Lys8-Tyr-Ile-Val-Gln-Lys-Leu-Lys-Lys-NH2, 1A2FR: Gln23-Arg-Ser-Val-Ser-Asn28-Ala-Ala-Tyr31-Arg-Val-Cys34(Acm)-NH2, 1A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Asn-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 2A2FR: Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 2A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Tyr-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2, 3A2FR: Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Lys31-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2 και 3A2AC: Ac-Gln-Arg-Ser-Val-Ser-Lys28-Ala-Ala-Lys31-Arg-Val-Cys(Acm)-NH2. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση κατά Merrifield και την Fmoc/tBu στρατηγική. Ο καθαρισμός των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με ημιπαρασκευαστική και παρασκευαστική RP-HPLC. Ο έλεγχος της καθαρότητας έγινε με αναλυτική RP-HPLC ενώ η ταυτοποίηση τους πραγματοποιήθηκε με ESI-MS. Οι διαμορφωτικές μελέτες των πεπτιδίων έγιναν μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού. Τα πεπτίδια εξετάστηκαν ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση έναντι τριών Gram (-) βακτηρίων, δύο Gram (+) βακτηρίων και ενός μύκητα, ενώ πραγματοποιήθηκαν πειράματα ελέγχου της κυτταροτοξικής δράσης τους έναντι της καρκινικής κυτταρικής σειράς Α-549, με τη μέθοδο ΜΤΤ. Επίσης μελετήθηκαν ως προς την τοξικότητά τους έναντί των ανθρώπινων ερυθροκυττάρων. Η σύνθεση, ταυτοποίηση και ο καθαρισμός των πεπτιδίων έλαβαν μέρος στο εργαστήριο Πεπτιδοχημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, ενώ η αντιμικροβιακή μελέτη και η αιμολυτική σταθερότητα στο εργαστήριο Βιοχημείας. Η μελέτη της αντικαρκινικής δράσης πραγματοποιήθηκε στη Μονάδα Τεχνικών Υποδομών και Μεθόδων Χαρακτηρισμού και Ελέγχου Βιοδραστικότητας Ουσιών. Τα πειράματα του κυκλικού διχρωϊσμού πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Τα αποτελέσματα έδειξαν μέτρια δράση έναντι των Gram (-) βακτηρίων, του μύκητα και των καρκινικών κυττάρων Α-549, ενώ έναντι των Gram (+) βακτηρίων δεν είχαν δράση. Κανένα πεπτίδιo δεν προκάλεσε αιμόλυση. Τα ποσοστά α-έλικας ήταν χαμηλά. Το πεπτίδιο 3A1FR είναι αυτό που ξεχώρισε, έχοντας τα μεγαλύτερα ποσοστά α-έλικας και την καλύτερη δράση (MIC Gram (-) βακτηρίων = 200 μg/ml), MIC μύκητα = 100 μg/ml, IC50 καρκινικών κυττάρων Α-549 = 130 μg/ml) ενώ στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις τα επίπεδα αιμόλυσης ήταν σχεδόν μηδενικά (EC = >500 μg/ml).