Παραγωγή και λειτουργικός ρόλος του υδρόθειου (H2S) στη κυτταρική σηματοδότηση με έμφαση στο καρκίνο και την αγγειογένεση

Abstract

Hydrogen sulfide (H2S), is a signaling molecule with multiple modes of action and biological functions. It regulates physiological processes such as vascular tone, angiogenesis and neurotransmission. Deregulation of its production is implicated in pathologies such as neurodegeneration, cancer and endocrine disorders. Endogenous hydrogen sulfide is in major part generated by two pyridoxal-5´-phosphate-dependent enzymes, cystathionine-γ-lyase (CSE) and cystathionine β-synthase (CBS), both using L-cysteine as the main substrate. Another enzymatic pathway involves the conversion of 3-mercaptopyruvate to hydrogen sulfide and pyruvate by 3-mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST.Although all three H2S-producing enzymes are expressed in the endothelium, the majority of vascular studies have focused on CSE due to the existence of research tools (selective pharmacological inhibitors and CSE KO mice). CBS KO mice exist only as heterozygotes because homozygosity is lethal in the first five eks of life. Although the presence of 3MST in the endothelium has been demonstrated, its role and effect on the angiogenic properties of endothelial cells has not been elucidated.Having both 3MST KO mice and selective 3MST pharmacological inhibitors at our disposal, we evaluated the angiogenic effect of 3MST on endothelial cells. We first studied the effect of four new 3MST pharmacological inhibitors in the angiogenic response of ECs. Moreover, using EC from 3MST KO we observed similarly reduced angiogenic responses. We have shown that silencing or deleting CSE reduced cell proliferation, sprouting from spheroids and from aortic rings. Silencing or deleting 3MST had inhibitory effects in these assays that were of smaller magnitude compared to CSE. Thus, inhibition of either CSE and 3MST leads to the reduction of angiogenenic properties in EC. In addition, we have shown that VEGF-induced angiogenesis is reduced in vivo in 3MST KO mice.Since endothelial cells rely primarily on glycolysis to meet their need for ATP, we wanted to examine the effect of 3MST inhibition on endothelial cell metabolism. Our metabolic data showed that some glycolytic intermediates accumulate in endothelial cells with reduced 3MST expression, while pyruvate levels decreased. These results suggest that glycolysis may be partially blocked at the level of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, aldolase or possibly pyruvate kinase. Some metabolites in the pentose phosphate (PPP) pathway were elevated suggesting that this pathway is also disrupted in cells with reduced 3MST expression. Collectively, these metabolic changes suggest that reduced 3MST expression in ECs (1) disrupts glycolytic activity and (2) redirects glucose to the pentose phosphate pathway.To further investigated 3MST-regulated energy production in ECs, mitochondrial respiration in intact EC was evaluated. Our results revealed reduced endothelial oxidative phosphorylation capacity with reduced 3MST expression, as assessed by Seahorse XF24 extracellular flux analyzer. 3MST inhibition also led to reduced mitochondrial ATP. Overall, the present study demonstrates the regulatory role of 3MST/H2S in the angiogenic responses of human ECs (e.g., proliferation, migration, and tubular network formation) and links them to metabolic changes in endothelial cells. Our study indicates that that suppression of 3MST significantly disrupts the metabolism of sulfur, nucleotides, proteins, fatty acids and carbohydrates. Stimulation of 3MST in ECs simultaneously supports the bioenergetic / metabolic and angiogenic functions of ECs, while inhibition of 3MST in ECs inhibits the "angiogenic / metabolic switch". In the last part of this dissertation we extended our study to cancer cells to study the role of hydrogen sulfide in 5-FU (5 fluorouracil) resistant colon cancer cells HCT116. We focused on the role of CBS, using the CBS inhibitor AOAA (Aminooxyacetic acid), which is known to inhibit colon cancer cell proliferation. Our main findings are that 1) The protein levels of CBS and 3MST increase in 5-FU HCT116-resistant cells and 2) 5-FU-resistant HCT116 are resistant (in terms of cell proliferation) to the anti-proliferative effect of AOAA.

Το υδρόθειο (H2S), είτε ενδογενώς παραγόμενο είτε εξωγενώς χορηγούμενο (μέσω «δοτών»), αποτελεί ένα σηματοδοτικό μόριο, με πλειοτροπικές και πολυπαραγοντικές βιολογικές δράσεις. Το H2S επηρεάζει διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως τη ρύθμιση του αγγειακού τόνου, την αγγειογένεση και τη νευροδιαβίβαση. Aπορρύθμιση της παραγωγής του μπορεί να οδηγήσει σε παθολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστικές νόσους, καρκίνο, κυκλοφορικές και ενδοκρινικές διαταραχές. Η βιοσύνθεσή του γίνεται από ένζυμα του μεταβολισμού της L-κυστεΐνης, τη β-συνθάση της κυσταθειονίνης (CBS) και τη γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) καθώς και από το ένζυμο σουλφοτρανσφεράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3MST). Παρόλο που και τα τρία ένζυμα παραγωγής H2S εκφράζονται στο ενδοθήλιο, η πλειονότητα των αγγειακών μελετών έχει επικεντρωθεί στο CSE λόγω της ύπαρξης εκλεκτικών φαρμακολογικών αναστολέων και ποντικιών στα οποία το γονίδιο CSE έχει απαλοιφθεί. Σημειώνεται ότι τα ποντίκια που δεν εκφράζουν CBS υπάρχουν μόνο ως ετερόζυγα διότι η ομοζυγία οφηγεί στο θάνατο τις πρώτες πέντε βδομάδες. Αν και η παρουσία του 3MST στο ενδοθήλιο, έχει αποδειχθεί εδώ και χρόνια, ο ρόλος και η επίδραση του στις αγγειογενετικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων δεν έχει αποσαφηνιστεί. Έχοντας στη διάθεση μας τόσο τα 3MST KO ποντίκια όσο και τους εκλεκτικούς φαρμακολογικούς αναστολείς του 3MST, θελήσαμε να αξιολογήσουμε την αγγειογενετική επίδραση του 3ΜSΤ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, χαρακτηρίσαμε τέσσερις νέους φαρμακολογικούς αναστολείς του 3ΜSΤ στην αγγειογενετική απόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα των 3MST KO ποντικών παρατηρήσαμε ομοίως μειωμένες αγγειογενετικές ιδιότητες. Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις δείξαμε ότι η σίγαση ή η απαλοιφή του CSE μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την δυνατότητα εκβλάστησης από σφαιροειδή ενδοθηλιακών κυττάρων και την εκβλάστηση από αορτικούς δακτυλίους. Η αποσιώπηση ή η απαλοιφή του 3MST ομοίως είχε ανασταλτικές δράσεις σε αυτές τις δοκιμασίες αλλά σε μικρότερο βαθμό από αυτήν του CSE. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα είναι γεγονός ότι η εξασθένιση τόσο του CSE όσο και του 3MST οδηγούν σε μειωμένη αγγειογένεση. Επιπλέον για πρώτη φορά, αποδεικνύουμε την μείωση της αγγειογένεσης in vivo σε απόκριση στο VEGF σε ποντίκια 3MST ΚΟ. Δεδομένου ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα βασίζονται κυρίως στη γλυκόλυση για να καλύψουν την ανάγκη τους για ΑΤΡ, θελήσαμε να εξετάσουμε την επίδραση την αναστολής του 3MST στο μεταβολισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα μεταβολομικά μας δεδομένα έδειξαν ότι ορισμένα γλυκολυτικά ενδιάμεσα συσσωρεύονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα με μειωμένη έκφραση 3MST, ενώ τα επίπεδα πυροσταφυλικού οξέος μειώνονταιν. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γλυκόλυση έχει μπλοκαριστεί μερικώς στο επίπεδο της 3-φωσφορικής δεϋδρογενάσης γλυκεραλδεΰδης, της αλδολάσης ή πιθανώς της πυροσταφυλικής κινάσης. Μερικοί μεταβολίτες στην οδό των φωσφορικών πεντοζών (ΡΡΡ) βρέθηκαν αυξημένοι υποδηλώνοντας ότι αυτή η οδός διαταράσσεται επίσης σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση 3MST. Συνολικά, αυτές οι μεταβολομικές αλλαγές θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ότι η μειωμένη έκφραση 3MST στα ECs (1) διαταράσσει τη γλυκολυτική δραστηριότητα και (2) ανακατευθύνει τη γλυκόζη προς την οδό των φωσφορικών πεντοζών.Για την περαιτέρω διερεύνηση της παραγωγής ενέργειας που ρυθμίζεται από το 3MST στα ECs, αξιολογήθηκε η μιτοχονδριακή αναπνοή σε άθικτα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν μειωμένη ικανότητα οξειδωτικής φωσφορυλίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων με μειωμένη έκφραση του 3MST, όπως αξιολογήθηκε από τον αναλυτή εξωκυτταρικής ροής Seahorse XF24. Επίσης, παρήγαγαν λιγότερο μιτοχονδριακό ΑΤΡ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.Συνολικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει τον ρυθμιστικό ρόλο του μονοπατιού 3MST/H2S στις αγγειογενετικές ιδιότητες των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων (π.χ. πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και σχηματισμός δικτύου τύπου σωλήνα) και στην μιτοχονδριακή αναπνοή σε συνδυασμό με αυξημένη παραγωγή μιτοχονδριακού ΑΤΡ. Η μελέτη χαρακτήρισε επίσης τις μεταβολικές αλλοιώσεις κυττάρων με μειωμένη έκφραση 3MST και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η καταστολή της 3MST, διαταράσσει σημαντικά τον μεταβολισμό του θείου, των νουκλεοτιδίων, των πρωτεϊνών, των λιπαρών οξέων και των υδατανθράκων. Το 3MST στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποστηρίζει τις βιοενεργητικές/μεταβολομικές και αγγειογενετικές λειτουργίες τους, ενώ η αναστολή του 3MST εμποδίζει τη λειτουργεία του «αγγειογενετικού/μεταβολικού διακόπτη». Στο τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής επεκτείναμε την μελέτη μας σε καρκινικά κύτταρα. Μελετήσαμε το ρόλο του υδροθείου σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου ανθεκτικά στην 5-FU (5 φθοριοουρακίλη). Συγκεκριμένα, επικεντρωθήκαμε στο ρόλο του CBS, χρησιμοποιώντας τον αναστολέα του AOAA (αμινοξυοξικό οξύ), ο οποίος είναι γνωστό ότι αναστέλλει το πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων κόλον. Τα κύρια ευρήματα είναι ότι 1) τα επίπεδα των πρωτεϊνών που παράγουν H2S, CBS και 3MST, αυξάνονται στα ανθεκτικά σε 5-FU HCT116 κύτταρα και 2)τα ανθεκτικά σε 5-FU HCT116 είναι λιγοτερο ευαίσθητα στην αντιπολλαπλασιαστική δράση του αναστολέα του CBS AOAA.