Μοριακές προσεγγίσεις μηχανισμών βιοαποδόμησης πολυαρωματικών υδρογονανθράκων

Abstract

Polycyclic aromatic hydrocarbons are among the most ubiquitous and recalcitrant environmental pollutants with adverse effects on human health. The optimization of bioremediation approaches in contaminated sites, though harnessing the enormous catabolic potential of bacteria, requires both the clarification of the catabolic pathways of the various pollutants from well-characterized bacterial strains and the profound understanding of the adaptive mechanisms employed by bacteria in the presence of such xenobiotic compounds.The aim of the present research study was the clarification of the phenanthrene degradation pathway from a new bacterial stain, which constitutes a new species of the genus Arthrobacter and was named Arthrobacter phenanthrenivorans (Sphe3). Recently, in collaboration with the Joint Genome Institute (JGI), the whole sequencing of its genome was completed.Through the genome’s in silico analysis, the study of gene expression with qRT-PCR, protein overexpression, as well as whole proteome analysis employing nanoLC/MS-MS in Sphe3 cells grown in the presence of phenanthrene, phthalate, glucose and in a mixture of phenanthrene with glucose, the characterization of all the enzymes implicated in the phenanthrene degradation pathway was accomplished.Functional characterization of the ring hydroxylating dioxygenase involved in phenanthrene initial hydroxylation was achieved and it was established that this particular dioxygenase shows high specificity towards phenanthrene.The functional characterization of the two genes encoding the 1-hydroxy-2-naphthoate dioxygenase ( large catabolic plasmid and Sphe3 chromosome), demonstrated that the encoded enzymes belong to the cupin protein family and exhibit similar catalytic properties. Both in silico and proteomic analysis verify that degradation of 1-hydroxy-2-naphthoate proceeds through either the ortho- or meta-cleavage of protocatechuate. The study of the genes encoding the enzymes implicated in the meta-cleavage of protocatechuate at the transcriptional level, showed that these genes are co-transcribed, constituting an operon. Both proteomic analysis and qPCR experimental results demonstrate that all the enzymes implicated in the phenanthrene degradation pathway are repressed, in the presence of the substrate of glucose.Experiments on the co-metabolic activity demonstrate the capability of the strain to fully co-metabolize fluorene and athracene and partially co-metabolize fluoranthene in the presence of phenanthrene. Furthermore, the proteomic analysis contributed to the substantial understanding of the adaptation mechanisms used by Sphe3 in the presence of xenobiotic compounds. Therefore, in the presence of aromatic substrates the differential expression of proteins involved in the central carbon and aminoacid metabolism, transport proteins, cell envelope proteins and stress related proteins, was observed. It should be noted that the present study constitutes the first proteomic study in the presence of PAHs and glucose in an Arthrobacter strain, since there is no previous reference in the literature.

Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs), συγκαταλέγονται στους πιο διαδεδομένους και επίμονους ρυπαντές του περιβάλλοντος με άμεση συνέπεια στην ανθρώπινη υγεία. Για τη βελτιστοποίηση των τεχνικών βιοαποκατάστασης των ρυπασμένων περιοχών, μέσω της εκμετάλλευσης του τεράστιου καταβολικού δυναμικού των μικροοργανισμών, απαραίτητη προϋπόθεση είναι αφενός η αποσαφήνιση των πορειών αποδόμησης των ρυπαντών από χαρακτηρισμένα βακτηριακά στελέχη και αφετέρου η σε βάθος κατανόηση των προσαρμοστικών μηχανισμών που ενεργοποιούνται στα βακτήρια παρουσία των ξενοβιοτικών αυτών ενώσεων. Σκοπός της παρούσης ερευνητικής μελέτης ήταν η αποσαφήνιση της πορείας βιοαποδόμησης του φαινανθρενίου από ένα νέο βακτηριακό στέλεχος, το οποίο αποτελεί νέο είδος του γένους Arthrobacter και έχει ονομαστεί Arthrobacter phenanthrenivorans (Sphe3). Πρόσφατα σε συνεργασία με το Joint Genome Institute (JGI), ολοκληρώθηκε η πλήρης αλληλούχιση του γονιδιώματός του.Μέσω της ανάλυσης in silico του γονιδιώματος, της μελέτης της έκφρασης γονιδίων με την τεχνική qRT-PCR, της υπερέκφρασης πρωτεϊνών, καθώς επίσης και της πρωτεωμικής ανάλυσης με nanoLC/MS-MS σε κύτταρα στελέχους Sphe3 που καλλιεργήθηκαν παρουσία φαινανθρενίου, φθαλικού, γλυκόζης και μίγματος φαινανθρενίου με γλυκόζη, πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός όλων των ενζύμων που εμπλέκονται στην πορεία καταβολισμού του φαινανθρενίου. Πραγματοποιήθηκε ο λειτουργικός χαρακτηρισμός της διοξυγονάσης αρχικής υδροξυλίωσης του φαινανθρενίου, η οποία μάλιστα διαπιστώθηκε οτι εμφανίζει απόλυτη εξειδίκευση ως προς το φαινανθρένιο.Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των δύο γονιδίων της διοξυγονάσης του 1-υδροξυ-2-ναφθοϊκού οξέος ( καταβολικό πλασμίδιο και χρωμόσωμα του στελέχους Sphe3), έδειξε ότι τα ένζυμα που κωδικεύουν ανήκουν στην οικογένεια των cupin πρωτεϊνών και έχουν παρόμοιες καταλυτικές ιδιότητες. Ο περαιτέρω καταβολισμός του 1-υδροξυ-2-ναφθοϊκού οξέος προχωράει είτε μέσω της ortho- είτε μέσω της meta-σχάσης του πρωτοκατεχοϊκού οξέος, όπως φάνηκε από την μελέτη in silico και αποδείχθηκε και από την πρωτεωμική ανάλυση. Η μελέτη των γονιδίων που κωδικεύουν τα ένζυμα της meta-σχάσης σε μεταγραφικό επίπεδο, έδειξε ότι τα γονίδια αυτά συμμεταγράφονται συνιστώντας ένα οργανωμένο οπερόνιο. Πειράματα συν-μεταβολισμού, έδειξαν τη δυνατότητα του στελέχους να συν-καταβολίζει πλήρως το φλουρένιο και το ανθρακένιο και μερικώς το φλουορανθένιο παρουσία του φαινανθρενίου.Τόσο από την πρωτεωμική ανάλυση όσο και από πειράματα qRT-PCR, φαίνεται ότι όλα τα ένζυμα που μετέχουν στην καταβολική πορεία του φαινανθρενίου καταστέλλονται παρουσία της γλυκόζης. Επιπλέον, η πρωτεωμική ανάλυση συνέβαλε και στην κατανόηση των μηχανισμών προσαρμογής του στελέχους Sphe3 παρουσία ξενοβιοτικών ενώσεων. Έτσι, παρουσία των αρωματικών υποστρωμάτων παρατηρήθηκε μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης ενζύμων του κεντρικού μεταβολισμού του άνθρακα και του μεταβολισμού των αμινοξέων, πρωτεϊνών μεταφορέων, πρωτεϊνών του κυτταρικού φακέλου και πρωτεϊνών που επάγονται παρουσία καταπόνησης. Η παρούσα πρωτεωμική ανάλυση αποτελεί και την πρώτη μελέτη παρουσία υποστρωμάτων PAHs και γλυκόζης σε στέλεχος Arthrobacter, αφού δεν υπάρχει κάποια πρότερη αναφορά στη διεθνή βιβλιογραφία.