Διερεύνηση του προβλεπτικού και προγνωστικού ρόλου της έκφρασης των γονιδίων BRCA1, RRM1, RRM2, hENT1, dCK και CDA στον προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

Background: Lung cancer is the most lethal malignant neoplasm worldwide, with non-small cell lung cancer (NSCLC) accounting for approximately 85% of the cases. More than half of NSCLC patients are diagnosed at an incurable stage. In the era of targeted and contemporary immunomodulatory therapies, cytotoxic chemotherapy retains an integral role in the management of advanced-stage/metastatic NSCLC, especially for patients lacking access to innovative anticancer drugs due to ineligibility and/or unaffordability. Moreover, as the addition of anti-EGFR agents, such as necitumumab, or immune-checkpoint inhibitors, such as pembrolizumab, to classical cytotoxic therapy have become novel treatment options in the first-line setting, customisation of chemotherapy would further improve the clinical effect of such combination strategies. The antimetabolite gemcitabine holds an essential role in the first-line setting either as a component of platinum-based regimens in eligible patients or, alternatively, combined with non-platinum compounds, and as single-agent in unfit patients. Given that standard gemcitabine-based chemotherapy has reached an efficacy plateau, the identification and clinical implementation of appropriate predictive biomarkers would help optimizing upfront treatment. Based on limited, predominantly retrospective clinical data, tumoural transcriptional levels of RRM1, RRM2, CDA, dCK and hENT1 genes -all being involved in the intracellular activity and metabolism of gemcitabine- are potential biomarkers for the drug’s efficacy in advanced-stage NSCLC. At the same time, BRCA1 mRNA expression is a candidate molecular predictor of tumour susceptibility to both platinum compounds and anti-mitotic chemotherapeutic agents, such as taxanes and vinorelbine, that are commonly combined with gemcitabine in the first-line setting of NSCLC. Aim: We explored the potential predictive value of the combined transcriptional patterns of an expanded panel including all five aforementioned gemcitabine sensitivity-related genes for clinical outcome to standard gemcitabine-based chemotherapy. Individual mRNA expression of the five studied genes was dichotomised by the corresponding median value into “high” versus “low”. The categorical trasnscription patterns of the potentially unfavourable genes CDA, RRM1 and RRM2, and the potentially favourable genes dCK and hENT1 were combined within each of the two groups, thus classifying the respective gene co-expression into “concordant high”, “concordant low” and “discordant/mixed”. In turn, the co-expression patterns of the favourable and unfavourable genes were used to generate a five-level, ordinal classification of tumoural gemcitabine sensitivity (5L-GSC), ranging from “very low” to “very high”. At the same time, we assessed the potential predictive value of BRCA1 mRNA expression (dichotomized as “high” versus “low”) separately in the two subgroups of patients treated with gemcitabine in combination with either platinum compounds or antimitotic drugs. In addition to their individual effects, we investigated the potential interaction of the two studied biomarkers (5L-GSC and BRCA1 expression) on clinical outcome measures. Materials and Methods: We retrospectively analyzed each gene’s relative mRNA expression by quantitative, real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) in microdissected, formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) primary-tumour specimens from 219 chemonaïve patients with histologically confirmed stage IV or recurrent NSCLC unamenable to local therapy, treated with gemcitabine -either as monotherapy or combined with platinum compounds, taxanes, vinorelbine or pemetrexed- in the context of 10 phase II, III and IV clinical trials conducted by the Hellenic Oncology Research Group and the Hellenic Cooperative Oncology Group, as previously described. Tumour specimens were collected for central laboratory testing, while clinicopathological data were retrieved from the corresponding trial databases. Both were obtained with the patients’ signed informed consent. The study was approved by the Ethics and Scientific Committee of the University General Hospital of Heraklion. (FFPE) specimens were pathologically reviewed for validity and adequate cellularity, while tumour cells were procured using a piezoelectric microdissector. Τoumoral RNA was extracted by the trizol LS method, treated with DNase and assessed for purity at 260/280 nm with NanoDrop-1000 Spectrophotometer. This was followed by complementary DNA (cDNA) synthesis using SuperScript III reverse transcriptase. TaqMan-based, relative RT-qPCR analysis was performed on ABI Prism 7900HT Sequence Detection System with appropriate non-template and non-reverse-transcribed RNA controls. Gene-specific, intron-spanning forward/reverse primer and probe sets were designed based on the NCBI Reference Sequence database and using Primer Express 2.0 Software. PCR experiments were run in triplicate for each target gene, while cDNA input corresponding to 15 ng RNA in a 12.5 μl final volume was used per reaction. The mRNA relative expression levels of each gene were calculated as a continuous variable by the 2-ΔΔCt method, using β-actin as a normalizing reference gene and commercial RNA as quantification calibrators. The target threshold cycle values were acceptable provided that the standard deviation between triplicates was below 0.3, according to the manufacturer’s suggestions. Molecular analysis was performed blinded to the clinical data. Statistics: The expectation-maximization approach was employed to impute missing transcript values of the dataset. Overall response rate (ORR), i.e.,, percentage of patients achieving complete and partial response (CR/PR), and disease control rate (DCR), i.e.,, percentage of patients achieving objective response and disease stabilization (SD), were defined by the RECIST v1.0 criteria, while time to progression (TTP) and overall survival (OS) were calculated from treatment initiation to the first documented disease progression (PD) or death from any cause, respectively. Multivariate analysis of variance (MANOVA) with type IV sum of squares and Pillai's trace as criterion was used to determine potential effects of patients’ and tumoural characteristics, as well as their interactions on the mRNA levels of all six studied genes, following rankit-based transformation of the corresponding values to achieve distribution normality. The Spearman’s rank coefficient test was used for pairwise correlation analysis of the gene expression profiles. The potential associations of BRCA1 expression, defined as a two level categorical variable, and 5L-GSC with ORR and DCR were tested univariably by the chi-square test with exact probabilities, as appropriate, in the corresponding groups of patients. The Kaplan–Meier method was used for plotting the TTP and OS curves, and estimating the corresponding median values, while the log-rank test evaluated their univariable association with the two biomarkers, separately, in the corresponding patient groups. In the total study population (219 patients), multivariable binary logistic regressions using a simultaneous (forced entry) model were carried out to calculate the odds ratios (OR) and 95% confidence intervals (CIs) for ORR defined as a dichotomous variable (i.e.,, objective response versus nonresponse) and DCR across the five levels of gemcitabine-sensitivity, with adjustment for several potential confounding factors, including performance status (PS), squamous (SCC) versus non-squamous (non-SCC) cell histology, addition of biological agents, and gemcitabine-based regimen grouped into monotherapy and combinations with either platinum compounds, antimitotic drugs (taxanes and vinorelbine) or antimetabolites (pemetrexed). Likewise, simultaneous, multivariable Cox proportional-hazards regression models assessed the potential independent predictive significance of 5L-GSC for PD and death, while estimating the corresponding adjusted hazard ratios (HR) and 95%CIs for each chemosensitivity level. Bias-corrected and accelerated (Bca) bootstrapping with 1000 replications was employed as an internal validation method for the multivariable regression-analysis results, while potential multicollinearity of the model predictors was assessed by the tolerance and variance inflation factor values. Furthermore, categorical regression with optimal scaling transformation (CATREG), combined with elastic-net regularization and the 0.632 bootstrap method with 200 iterations were applied to identify the most parsimonious model with the highest prediction accuracy for overall tumour response, the latter defined as a three-category variable (i.e.,, CR/PR versus SD versus PD). A similar multivariate statistical approach and validation methodology were used to explore the correlation of BRCA1 mRNA expression with clinical outcome in the two above-mentioned chemotherapy subgroups, i.e, in the 76 patients treated with gemcitabine-plus-platinum doublets, as well as in the 122 patients treated with gemcitabine-plus-antimitotic regimens. For all statistical analyses, the two-tailed level of significance was set at p-value ≤ 5%. Results: PCR amplification was successful for all six genes under study in approximately 95% of tumour specimens. Patients were predominantly male (88%), with a median age of 66 years and a good performance status (ECOG PS 0-1, 91%). Around 69% of participants had stage IV-M1b and 22% stage IV-M1a disease (7th UICC TNM edition). Non-SCCs comprised ~60% of the tumours. In more than half of the patients, gemcitabine was combined with anti-mitotics, whereas more than one-third received gemcitabine/platinum doublets. Biological agents, such as bevacizumab and bortezomib, were added to first-line regimens in 8% of cases. Data on subsequent therapy were available for 85% of patients, of whom 35% received no other treatment. Among the clinico-histopathological features studied, only PS emerged as an independent prognostic factor for clinical outcome, in particular TTP and OS. Although no statistically significant correlations were revealed between any of the clinic-histopathological features and the linear combination of the transcriptional levels of the six studied genes (i.e, as a whole), a significant but limited and disordinal (cross-over) interaction effect of gender and histological type was observed on CDA mRNA levels, with a differential expression between squamous and nonsquamous carcinomas in male patients. Significant and moderate (i.e, r-value ≥ 0.3), positive, pairwise expression correlations were seen between the unfavourable genes RRM1 and RRM2 and between the favourable genes dCK and hENT1. Furthermore, there were significant positive pairwise correlations between the mRNA levels of both former genes and the two latter, indicating a simultaneous activity of the two functionally competitive gene groups. More specifically, dCK mRNA expression correlated moderately with RRM1 and strongly with RRM2 expression, while hENT1 mRNA expression correlated weakly to moderately with the expression of RRM1 and RRM2, respectively. Besides, BRCA1 mRNA levels were positively and moderately correlated with those of RRM1, RRM2 and dCK. 5L-GSC was independently associated with all four clinical endpoints -ORR (p=0.03), DCR (p=0.004), TTP (p<0.001) and OS (p<0.001)- in multivariable regression models adjusting for other factors such as tumour histology and chemotherapy regimen, and after excluding collinearity among the predictor variables. Furthermore, the magnitude of chemotherapy efficacy increased progressively across the five classification groups and in accordance with the scale level of gemcitabine-susceptibility, with the values of outcome measures for the moderate-chemosensitivity group resembling those for the total study population. These, in turn, were as expected by current standards for the first-line chemotherapy setting. The multivariable regression analysis results regarding the effect of 5L-GSC on clinical outcome retained their statistical significance after Bca bootstrapping validation, while multicollinearity was excluded. Penalised, optimally-scaled, categorical-regression modelling of overall response identified 5L-GSC as the most stable predictor, and the corresponding expected prediction error was estimated at 0.615 (±0.033). BRCA1 mRNA expression defined as a two-level categorical variable was significantly correlated with all outcome measures (ORR, DCR, TTR and OS) in multivariable regression analyses and independently of 5L-GSC in both chemotherapy subgroups, but in a differential manner. In particular, whereas low BRCA1 expression had a favourable impact on clinical outcome in the subgroup of patients treated with gemcitabine-plus-platinum combinations, its corresponding effect among those receiving gemcitabine and antimitotic agents was detrimental. As in the case of 5L-GSC, the above-mentioned results remained statistically significant by internal validation (Bca bootstrap) and were unaffected by multicollinearity. No significant differences regarding the frequency or type of second-line therapy were seen among the levels/categories of either of the two biomarkers. A statistically significant and favourable, synergistic, interaction effect was observed between low BRCA1 expression and 5L-GSC status on OS, as reflected by a progressive increase in the latter’s median from 4.9 months among patients with tumours of “very low-gemcitabine sensitivity” and low BRCA1 expression to 41.6 months among those with tumours of “ very high-gemcitabine sensitivity” and low BRCA1 expression. Lastly, among the 117 patients for whom data on the type of disease response to 2nd-line therapy were available, no statistically significant correlation was observed between clinical outcome and either 5L-GSC or BRCA1 mRNA expression. Conclusions: Combined transcriptional-expression profiling of CDA, RRM1, RRM2, dCK and hENT1, along with BRCA1 mRNA expression in the primary tumour are promising biomarkers that could serve as predictive tools for guiding front-line gemcitabine-based chemotherapy in advanced-stage NSCLC. Their potential clinical utility -either individually and/or in combination- merits external validation and prospective evaluation.

Εισαγωγή: Με την ένταξη κατά την τελευταία δεκαετία των αντινεοπλασματικών παραγόντων στόχευσης και των νεότερης γενιάς ανοσοθεραπειών στην πρώτη γραμμή αντιμετώπισης του προχωρημένου/μεταστατικού μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (ΜΜΚΠ), το πρότυπο θεραπευτικής προσέγγισης της νόσου έχει σταδιακά αλλάξει. Στο πλαίσιο αυτό, η κλασική κυτταροτοξική χημειοθεραπεία διατηρεί σημαντικό ρόλο, όχι μόνο για τους ασθενείς με αδυναμία πρόσβασης στα καινοτόμα φάρμακα ή μη πλήρωση των αντίστοιχων κριτηρίων επιλεξιμότητας, αλλά και ως αναπόσπαστο μέρος σχημάτων συνδυαστικής αντινεοπλασματικής θεραπείας με βιολογικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων της μπεβασιζουμάμπης, της νεσιτουμουμάμπης και των αναστολέων των ανοσιακών σημείων ελέγχου.Αν και η καθιερωμένη για τη νόσο χημειοθεραπεία 1ης γραμμής βασίζεται στην σιπλατίνη και την καρβοπλατίνη, οι διπλέτες της γεμσιταβίνης με αντιμιτωτικούς παράγοντες, όπως τις ταξάνες και τη βινορελβίνη, αποτελούν εναλλακτικά σχήματα με ανώτερο προφίλ ασφάλειας και ιδιαίτερα ελκυστική επιλογή για τους ασθενείς με συννοσηρότητες ή/και αντένδειξη χορήγησης των πλατινούχων σκευασμάτων. Από τη βιβλιογραφική ανασκόπηση φαίνεται ότι η συμπερίληψη της γεμσιταβίνης στη χημειοθεραπεία 1ης γραμμής του ΜΜΚΠ πλεονεκτεί έναντι άλλων φαρμάκων 3ης γενιάς σε συγκεκριμένες παραμέτρους κλινικής έκβασης, με τους πλατινούχους και μη συνδυασμούς της να παρέχουν παρόμοια μεταξύ τους αποτελέσματα ως προς την συνολική επιβίωση και με το όφελος χρήσης της να μην περιορίζεται στον πλακώδη ιστολογικό τύπο. Σε κάθε περίπτωση, οι δείκτες αποτελεσματικότητας της κυτταροτοξικής χημειοθεραπείας στην 1η γραμμή του ΜΜΚΠ παρουσιάζουν εικόνα επιπέδωσης (plateau). Σύμφωνα με προκλινικά και περιορισμένα, μη καταληκτικά κλινικά δεδομένα, τα επίπεδα μεταγραφικής (mRΝΑ) έκφρασης των γονιδίων RRM1, RRM2, CDA, dCK, hENT1 και BRCA1 -είτε μεμονωμένα, είτε σε συνδυασμό- αποτελούν υποψήφιους φαρμακογενετικούς βιοδείκτες που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη βελτιστοποίηση της απόδοσης της χημειοθεραπείας βασισμένης στη γεμσιταβίνη στο εν λόγω πλαίσιο. Σκοπός: Πρωτεύον αντικείμενο της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η δημιουργία ενός σύνθετου, περιγραφικού βιοδείκτη χημειοευαισθησίας βασισμένου στην ενδο-ογκική μεταγραφική έκφραση των πέντε γονιδίων CDA, RRM1, RRM2, dCK και hENT1 -τα οποία εμπλέκονται στην ενδοκυττάρια πρόσληψη, ενεργοποίηση/αδρανοποίηση και δραστικότητα της γεμσιταβίνης- και η διερεύνηση της ενδεχόμενης προβλεπτικής του ικανότητας για την κλινική έκβαση των ασθενών με προχωρημένο/μεταστατικό ΜΜΚΠ που υποβάλλονται σε συστηματική χημειοθεραπεία 1ης γραμμής βασισμένη στον εν λόγω αντιμεταβολίτη. Ο προτεινόμενος ταξινομητής χημειοευαισθησίας (5-level gemcitabine-sensitivity classifier, 5L-GSC) συνίσταται από πέντε επίπεδα/βαθμίδες ευαισθησίας στη γεμσιταβίνη (από «πολύ χαμηλή» έως «πολύ υψηλή») και προέκυψε: (α) από την κατηγοριοποίηση της έκφρασης των πέντε επιμέρους γονιδίων σε «υψηλή» και «χαμηλή» με βάση τη διάμεση τιμή των αντίστοιχων επιπέδων mRNA και (β) από όλους τους συνδυασμούς έκφρασης των δυνητικά ευνοϊκών (dCK και hENT1) και δυσμενών (CDA, RRM1 και RRM2) για τη δραστικότητα του φαρμάκου γονιδίων. Παράλληλα διερευνήθηκε ο προβλεπτικός ρόλος της επιμέρους mRΝΑ έκφρασης των πιο πάνω γονιδίων, καθώς επίσης της συνέκφρασης των δύο δυσμενών και των τριών ευνοϊκών γονιδίων.Ένας άλλος στόχος της μελέτης ήταν η επιβεβαίωση των προκλινικών και κλινικών ενδείξεων για τη διαφορική αλληλεπίδραση της μεταγραφικής έκφρασης του γονιδίου BRCA1 με τη δραστικότητα των παραγώγων πλατίνης, από την μια, και των αντιμιτωτικών παραγόντων, από την άλλη, δηλαδή των δύο κατηγοριών κυτταροτοξικών φαρμάκων με τα οποία συνδυάζεται η γεμσιταβίνη στο συγκεκριμένο θεραπευτικό πλαίσιο. Επιπλέον, η παρούσα ερευνητική εργασία διερεύνησε την ενδεχόμενη αλληλεπίδραση που έχει στην κλινική έκβαση η BRCA1 έκφραση με τον προτεινόμενο βιοδείκτη 5L-GSC.Απώτερος σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ένταξη και χρήση των παραπάνω, υποψήφιων, φαρμακογενωμικών βιοδεικτών στην καθημερινή κλινική πράξη ως υποβοηθητικών εργαλείων για την εξατομίκευση της χημειοθεραπείας 1ης γραμμής στον προχωρημένο/μεταστατικό ΜΜΚΠ.Υλικό και μεθοδολογία: Πρόκειται για αναδρομική μελέτη μεταφραστικής έρευνας όπου χρησιμοποιήθηκαν (α) παραφινοποιημένα και μονιμοποιημένα παρασκευάσματα βιοψίας του πρωτοπαθούς όγκου και (β) τα ιατρικά δεδομένα 219 ασθενών με προχωρημένο/μεταστατικό ΜΜΚΠ οι οποίοι έλαβαν χημειοθεραπεία 1ης γραμμής με βάση τη γεμσιταβίνη στα πλαίσια 10 παρεμβατικών κλινικών μελετών φάσης 1/2, 3 και 4 στον Ελλαδικό χώρο τη χρονική περίοδο 2001-2016. Στα κριτήρια ένταξης των ασθενών στην παρούσα ερευνητική εργασία συμπεριλήφθηκαν η επάρκεια του αρχειακού ιστοπαθολογικού υλικού και η διαθεσιμότητα των δεδομένων κλινικής έκβασης, με ελάχιστη απαιτούμενη πληροφορία τον τύπο βέλτιστης ανταπόκρισης στη θεραπεία. Η εργαστηριακή επεξεργασία του βιοπτικού υλικού των ασθενών διενεργήθηκε τυφλά και ανεξάρτητα από την ανάκληση των κλινικών πληροφοριών που είχαν καταχωρηθεί προοπτικά στις αντίστοιχες βάσεις δεδομένων.Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της επιπέδων mRΝΑ των 6 υπό μελέτη γονιδίων στον πρωτοπαθή όγκο των ασθενών ακολουθήθηκαν αδρά τα εξής διαδοχικά στάδια επεξεργασίας του αρχειακού βιοπτικού τους υλικού: (α) εκλεκτικός διαχωρισμός των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση πιεζοηλεκτρικού μικροτόμου υπό την καθοδήγηση ενσωματωμένου ανεστραμμένου οπτικού μικροσκοπίου, (β) εκχύλιση, απομόνωση και καθαρισμός του RNA των καρκινικών κυττάρων, (γ) φασματοφωτομετρική ανάλυση του RNA, (δ) ποσοτική, πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR) δύο σταδίων και (ε) σχετική ποσοτικοποίηση της μεταγραφικής έκφρασης των εν λόγω γονιδίων με την συγκριτική μέθοδος ΔΔCq. Κατά το πρώτο στάδιο της RT-qPCR πραγματοποιήθηκε σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cDNA) με εκμαγείο το συνολικό RNA κάθε δείγματος, τη χρήση τυχαίων εκκινητών και υπό την ενζυμική κατάλυση της αντίστροφης μεταγραφάσης, ενώ κατά το δεύτερο στάδιο χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές (primers) και υδρολυόμενοι ιχνηθέτες τύπου TaqManTM (probes) που σχεδιάστηκαν ειδικά για το καθένα από τα 6 υπό μελέτη γονίδια. Για την κανονικοποίηση (normalization) των τιμών της μεταγραφικής έκφρασης επιλέχθηκε η β-ακτίνη ως ενδογενές γονίδιο αναφοράς, ενώ για σκοπούς βαθμονόμησης (calibration) χρησιμοποιήθηκαν και στα δύο στάδια της RT-qPCR δείγματα εμπορικά διαθέσιμου RNA από ανθρώπινο φυσιολογικό ιστό πνεύμονα και ήπατος που έτυχαν της ίδιας επεξεργασίας με τα δείγματα RNA του όγκου των ασθενών.Η ερευνητική εργασία διεξάχθηκε στο Εργαστήριο Μεταφραστικής Ογκολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Κρήτης σε συνεργασία με το Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου (ΠΑ.Γ.Ν.Η), σύμφωνα με τους γενικά παραδεδεγμένους κανόνες ηθικής και δεοντολογίας της βιοϊατρικής έρευνας.Στατιστική ανάλυση: Για τη διαχείριση τυχόν ελλιπών δεδομένων (missing data) που αφορούσαν στα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης κατά την εκτέλεση της RT-qPCR, εφαρμόστηκε ο αλγόριθμος προσδοκίας-μεγιστοποίησης (expectation-maximization). Η συσχέτιση των επιπέδων mRNA των 6 υπό μελέτη γονιδίων ως εξαρτημένων ποσοτικών μεταβλητών με τα χαρακτηριστικά των ασθενών και του όγκου διερευνήθηκε με την μέθοδο της πολυπαραγοντικής, πολυμεταβλητής ανάλυσης της διακύμανσης (multifactorial, multivariate analysis of variance-MANOVA), χρησιμοποιώντας το άθροισμα τετραγώνων τύπου IV και το ίχνος (trace) του Pillai ως κριτήριο στατιστικής σημαντικότητας, τόσο για την επιμέρους επίδραση (main effect) των ανεξάρτητων παραμέτρων, όσο και για τις ανά ζεύγη αλληλεπιδράσεις (interactions) επί της γονιδιακής έκφρασης, αφού προηγήθηκε κανονικοποίηση των τιμών έκφρασης όλων των γονιδίων με τη φόρμουλα μετασχηματισμού rankit. Παράλληλα, η ανά ζεύγη συσχέτιση της έκφρασης μεταξύ των γονιδίων ελέγχθηκε με βάση τον μη-παραμετρικό συντελεστή συσχέτισης Spearman (ρ). Η μεταγραφική έκφραση των 6 υπό μελέτη γονιδίων έτυχε χειρισμού ως διχοτόμου κατηγορικής μεταβλητής («χαμηλής» έναντι «υψηλής έκφρασης») με βάση τη διάμεση τιμή των αντίστοιχων mRNA επιπέδων, τόσο κατά τη διαμόρφωση των σύνθετων φαρμακογενωμικών δεικτών (δηλαδή της συνέκφρασης των ευνοϊκών και των δυσμενών για τη γεμσιταβίνη γονιδίων και του 5L-GSC), όσο και κατά τον στατιστικό έλεγχο της συσχέτισης τους με την κλινική έκβαση. Για τους υποψήφιους βιοδείκτες που σχετίζονται με τη δραστικότητα της γεμσιταβίνης, ο εν λόγω έλεγχος διενεργήθηκε στο σύνολο των 219 ασθενών της μελέτης, ενώ για την μεταγραφική έκφραση του BRCA1 και την ενδεχόμενη αλληλεπίδραση της με τον 5L-GSC, ο έλεγχος έγινε ξεχωριστά στις δύο υπο-ομάδες των 122 και των 76 ασθενών που έλαβαν, αντίστοιχα, γεμσιταβίνη σε συνδυασμό με ταξάνες ή βινορελβίνη και με πλατινούχα παράγωγα.Με τη χρήση των κατάλληλων μονοπαραγοντικών (χ2-test exact & log-rank test) και πολυπαραγοντικών (binary logistic regression & Cox proportional hazard regression) στατιστικών δοκιμασιών διερευνήθηκε η συσχέτιση των υποψήφιων μοριακών βιοδεικτών με τα εξής τέσσερα καταληκτικά σημεία κλινικής έκβασης: το ποσοστό αντικειμενικής κλινικής ανταπόκρισης (ORR), το ποσοστό ελέγχου της νόσου (DCR), το χρονικό διάστημα έως την επιδείνωση της νόσου TTP) και την συνολική επιβίωση (OS). Στα αντίστοιχα πολυπαραμετρικά, προβλεπτικά μοντέλα παλινδρόμησης συμπεριλήφθηκαν δυνητικά συγχυτικοί παράγοντες, όπως το επίπεδο φυσικής/λειτουργικής κατάστασης των ασθενών (performance status, PS), o ιστολογικός τύπος του όγκου και η κατηγορία του χημειοθεραπευτικού σχήματος, ενώ για τα καταληκτικά σημεία έκβασης ORR και DCR ελέγχθηκε το ενδεχόμενο της αλληλεπίδρασης των ανεξάρτητων παραμέτρων (φαινόμενο πολυσυγγραμμικότητας). Επιπλέον, για τη διασταυρούμενη επαλήθευση (έλεγχο εσωτερικής εγκυρότητας) των στατιστικά σημαντικών αποτελεσμάτων που προέκυψαν από την πολυπαραγοντική ανάλυση, εφαρμόστηκε η μέθοδος της αναδειγματοληψίας με διόρθωση της μεροληψίας εκτίμησης και επιτάχυνση της σύγκλισης κατανομής (bias-corrected, accelerated bootstrapping). Σε όλες τις δοκιμασίες στατιστικού ελέγχου ως επίπεδο αμφίπλευρης στατιστικής σημαντικότητας (two-tail p-value) ορίστηκε η τιμή ≤ 5%, ενώ σε όλες τις περιπτώσεις πολλαπλών, ανά ζεύγη, συγκριτικών ελέγχων τα αποτελέσματα έτυχαν διόρθωσης με την μέθοδο Holm-Bonferroni.Κατά τον πολυπαραγοντικό έλεγχο της ικανότητας του προτεινόμενου βιοδείκτη 5L-GSC να προβλέψει τον τύπο της βέλτιστης ανταπόκρισης ως τριωνυμικής μεταβλητής (πλήρης ή μερική ανταπόκριση versus σταθεροποίηση versus επιδείνωση της νόσου) εκτιμήθηκε το αναμενόμενο σφάλμα πρόβλεψης (expected prediction error) επί εξωγενών παρατηρήσεων και ακολουθήθηκε σύνθετη στατιστική μεθοδολογία με κανονικοποίηση (regularization) των συντελεστών παλινδρόμησης μέσω επιβολής ποινής ώστε να ελαχιστοποιηθεί το φαινόμενο της υπερπροσαρμογής (overfitting) που επάγει η πολυπλοκότητα του προβλεπτικού μοντέλου.Αποτελέσματα: Τα κλινικο-ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των 219 ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν αντιπροσωπευτικά των περιστατικών που πληρούν τις προϋποθέσεις χορήγησης χημειοθεραπείας 1ης γραμμής στην καθημερινή κλινική πράξη, ενώ τα αποτελέσματα κλινικής έκβασης ήταν σύμφωνα με τα καθιερωμένα πρότυπα πριν την ένταξη στη φαρμακευτική φαρέτρα των νεότερων ανοσοθεραπειών και των θεραπειών στόχευσης.Οι ασθενείς ήταν κατεξοχήν άνδρες, με διάμεση ηλικία τα 66 έτη και στην πλειονότητα τους με επίπεδο λειτουργικής κατάστασης ≤1 κατά ECOG. Το 69% και 22% των ασθενών είχαν, αντίστοιχα, στάδιο νόσου M1b και M1a με βάση την 7η έκδοση του UICC/AJCC συστήματος ΤΝΜ σταδιοποίησης, ενώ οι υπόλοιποι παρουσίαζαν τοπικοπεριοχική υποτροπή χωρίς δυνατότητα ριζικής αντιμετώπισης. Σε ποσοστό περίπου 60% των περιπτώσεων, ο ιστολογικός τύπος του όγκου ήταν ΜΜΚΠ από μη πλακώδες επιθήλιο. Πάνω από τους μισούς ασθενείς έλαβαν τη γεμσιταβίνη σε συνδυασμό με αντιμιτωτικό παράγοντα (ταξάνη ή βινορελβίνη), πάνω από το ένα τρίτο ως συστατικό πλατινούχου διπλέτας και περίπου 9% ως μονοθεραπεία. Το θεραπευτικό σχήμα 1ης γραμμής συμπεριέλαβε βιολογικούς παράγοντες (μπεβασιζουμάμπη ή βορτεζομίμπη) στο 8.2% των περιπτώσεων. Δεδομένα για την συστηματική αντινεοπλασματική θεραπεία που επακολούθησε ήταν διαθέσιμα για περίπου το 85% των ασθενών, εκ των οποίων το 35% δεν έλαβαν οποιαδήποτε άλλη αγωγή, ενώ σε ποσοστό περίπου 5% του συνόλου επαναχορηγήθηκε σχήμα που περιείχε τη γεμσιταβίνη. Σε ποσοστό που κυμάνθηκε περίπου από 5% έως 6% του συνόλου των ασθενών, η ενίσχυση της RNA αλληλουχίας-στόχου κατά τη διενέργεια της RT-qPCR ήταν ανεπιτυχής για ένα έως τρία από τα 6 υπό μελέτη γονίδια, αντίστοιχα, με την απουσία των εν λόγω δεδομένων (missing data) να προέρχεται από τυχαίο μηχανισμό (Welch's t-test - p>0.002). H κατανομή των τιμών των mRNA επιπέδων ήταν μη κανονική για όλα τα γονίδια. Κατόπιν επικύρωσης με την μέθοδο της αναδειγματοληψίας (Bca bootstrap), η συσχέτιση της μεταγραφικής έκφρασης των γονιδίων παρέμεινε στατιστικά σημαντική, θετικού προσήματος και τουλάχιστον μέτριας ισχύος για τα ζεύγη RRM1-RRM2, dCK-RRM1, dCK-RRM2, BRCA1-RRM1, BRCA1-RRM2 και BRCA1-dCK, υποδηλώνοντας μια τάση σύγχρονης μεταγραφικής δραστηριότητας όχι μόνο ανάμεσα στα γονίδια με παρόμοια αλληλεπίδραση στη δραστικότητα της γεμσιταβίνης, αλλά και μεταξύ λειτουργικά ανταγωνιστικών γονιδίων, καθώς επίσης μια τάση συνέκφρασης του BRCA1 τόσο με τα δυνητικά ευνοϊκά, όσο και με τα δυνητικά δυσμενή για τη γεμσιταβίνη γονίδια.Από τα κλινικο-ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και του όγκου, μόνο το PS των ασθενών αναδείχθηκε ανεξάρτητος, στατιστικά σημαντικός προβλεπτικός παράγοντας για την κλινική έκβαση και ειδικότερα για τον ΤΤΡ και την ΟS. Αν και δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των κλινικο-ιστοπαθολογικών παραμέτρων με τo σύνολο (γραμμικό συνδυασμό) της μεταγραφικής έκφρασης των 6 υπό μελέτη γονιδίων, καταγράφηκε μια περιορισμένου βαθμού, αντίθετης φοράς αλληλεπίδραση του φύλου των ασθενών και του ιστολογικού τύπου του καρκίνου στην έκφραση του γονιδίου CDA, με την μέση τιμή της τελευταίας να είναι μεγαλύτερη στις γυναίκες με πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα και στους άντρες με ΜΜΚΠ από μη-πλακώδες επιθήλιο. Η διαφοροποίηση αυτή στην CDA έκφραση μεταξύ των όγκων από πλακώδες και μη επιθήλιο ήταν στατιστικά σημαντική μόνο στο ανδρικό φύλο.Όσον αφορά στην συσχέτιση της κλινικής έκβασης με την mRNA έκφραση των 5 επιμέρους γονιδίων που σχετίζονται με τη δραστικότητα της γεμσιταβίνης, οριζόμενη ως διχοτόμο κατηγορική μεταβλητή («χαμηλή versus υψηλή»), ως ανεξάρτητοι και στατιστικά σημαντικοί προβλεπτικοί παράγοντες προέκυψαν: (α) για το ΟRR, η έκφραση των CDA και RRM1, (β) για το DCR, εκείνη των RRM1, dCK και hENT1, ενώ (γ) για τον ΤΤΡ και (δ) την OS, η έκφραση των CDA, dCK και hENT1. Παράλληλα, η συνέκφραση των τριών δυνητικά δυσμενών γονιδίων CDA, RRM1 και RRM2 οριζόμενη ως κατηγορική μεταβλητή («συγκλίνουσα χαμηλή versus μεικτή/αποκλίνουσα versus συγκλίνουσα υψηλή») ήταν ανεξάρτητος προβλεπτικός παράγοντας και για τα τέσσερα καταληκτικά σημεία, ενώ η αντίστοιχη συνέκφραση των δύο δυνητικά ευνοϊκών γονιδίων dCK και hENT1 είχε την ίδια αυτή ιδιότητα για το DCR, τον TTP και την OS. Η παραπάνω επίδραση της συνδυαστικής έκφρασης των γονιδίων στην κλινική έκβαση ήταν μεγαλύτερου μεγέθους απ’ ότι η επιμέρους, μεμονωμένη έκφραση τους.Μεταξύ των υποψήφιων φαρμακογενετικών βιοδεικτών, ο προτεινόμενος ταξινομητής χημειοευαισθησίας πέντε βαθμίδων 5L-GSC αναδείχθηκε ανεξάρτητος προβλεπτικός παράγοντας και για τα τέσσερα καταληκτικά σημεία, έχοντας τον υψηλότερο βαθμό στατιστικής σημαντικότητας (με τιμές p=0.03, 0.004, <0.001 και <0.001 για το ORR, DCR, TTP και OS, αντίστοιχα) και το μεγαλύτερο μέγεθος επίδρασης στην κλινική έκβαση του συνόλου των ασθενών της μελέτης. Ενδεικτικά, οι σταθμισμένες τιμές του λόγου συμπληρωματικών πιθανοτήτων (adjusted odds ratio, OR) για το DCR στους όγκους «πολύ υψηλής», «υψηλής» και «ενδιάμεσης ευαισθησίας στη γεμσιταβίνη» ήταν, αντίστοιχα, 16.66, 10.83 και 5.2 σε σχέση με τους όγκους «πολύ χαμηλής ευαισθησίας», ενώ οι αντίστοιχες τιμές του σχετικού στιγμιαίου κινδύνου (adjusted hazard ratio, HR) για τον ΤΤΡ ήταν 0.04, 0.11 και 0.22 συγκριτικά με το επίπεδο αναφοράς. Όσον αφορά στην επίσης ευνοϊκή συσχέτιση του 5L-GSC με την OS, αξίζει να σημειωθεί ότι η συχνότητα χορήγησης και ο τύπος της θεραπείας 2ης γραμμής δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά μεταξύ των πέντε επιμέρους κατηγοριών του προτεινόμενου βιοδείκτη, με τη διάμεση τιμή της OS να κυμαίνεται από 11.1 έως 23.5 μήνες στους ασθενείς με όγκους ενδιάμεσης έως πολύ υψηλής ευαισθησίας στη γεμσιταβίνη συγκριτικά με 1.8 μήνες στους ασθενείς με όγκους πολύ χαμηλής ευαισθησίας. Η κλινική έκβαση των ασθενών με όγκους ενδιάμεσης ευαισθησίας ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του συνόλου των 219 ασθενών.Κατά τον έλεγχο της εσωτερικής εγκυρότητας των αποτελεσμάτων της πολυπαραγοντικής ανάλυσης με την μέθοδο της αναδειγματοληψίας επικυρώθηκε η στατιστική σημαντικότητα της συσχέτισης των καταληκτικών σημείων κλινικής έκβασης με όλους τους παραπάνω υποψήφιους βιοδείκτες, ενώ παράλληλα αποκλείστηκε το ενδεχόμενο της πολυσυγγραμμικότητας.Κατά την αναζήτηση του πλέον φειδωλού πολυπαραμετρικού μοντέλου με τη βέλτιστη ικανότητα πρόβλεψης του τύπου της αντικειμενικής ανταπόκρισης της νόσου ως τριωνυμικής κατηγορικής μεταβλητής («πλήρης ή μερική ανταπόκριση» versus «σταθεροποίηση» versus «επιδείνωση»), ο προτεινόμενος 5L-GSC ήταν ο μόνος ανάμεσα σε οκτώ υποψήφιους παράγοντες που πληρούσε τα εν λόγω κριτήρια, με την τιμή του αναμενόμενου σφάλματος πρόβλεψης σε εξωγενή, ανεξάρτητα δεδομένα να εκτιμάται σε 0.615 (±0.033).Ο προβλεπτικός ρόλος της BRCA1 έκφρασης ως διωνυμικής κατηγορικής μεταβλητής («χαμηλής versus υψηλής έκφρασης») ήταν στατιστικά σημαντικός και για τα τέσσερα καταληκτικά σημεία κλινικής έκβασης (ΟRR, DCR, TTP και OS), ανεξάρτητος από το status του 5L-GSC, αλλά διαφορικός ανάλογα με τον τύπο της χημειοθεραπείας. Συγκεκριμένα, ενώ στην υπο-ομάδα των ασθενών που έλαβαν γεμσιταβίνη σε συνδυασμό με πλατινούχα σκευάσματα η χαμηλή BRCA1 έκφραση είχε ευνοϊκή επίδραση, η αντίστοιχη επίδραση της στην υπο-ομάδα ασθενών υπό γεμσιταβίνη και αντιμιτωτικούς παράγοντες ήταν δυσμενής. Όπως και με τους προηγούμενους βιοδείκτες, η στατιστική σημαντικότητα διατηρήθηκε κατά τον έλεγχο της εσωτερικής επικύρωσης, ενώ αποκλείστηκε το ενδεχόμενο της πολυσυγραμματικότητας. Επιπλέον, η συχνότητα χορήγησης και ο τύπος της θεραπείας 2ης γραμμής δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά μεταξύ των ασθενών με όγκους χαμηλής και υψηλής έκφρασης του BRCA1.Στους ασθενείς υπό συνδυαστική χημειοθεραπεία γεμσιταβίνης/πλατινούχων σκευασμάτων καταγράφηκε μια στατιστικά σημαντική και ευνοϊκή αλληλεπίδραση της χαμηλής έκφρασης του BRCA1 με το status του 5L-GSC στην OS, με προοδευτική αύξηση της διάμεσης τιμής από 4.9 μήνες στους όγκους πολύ χαμηλής ευαισθησίας στη γεμσιταβίνη και με ταυτόχρονα χαμηλή BRCA1 έκφραση σε 41.6 μήνες στους όγκους πολύ υψηλής ευαισθησίας στη γεμσιταβίνη και με ταυτόχρονα χαμηλή BRCA1 έκφραση.Τέλος, στους 117 ασθενείς όπου υπήρχαν διαθέσιμα δεδομένα για τον τύπο της ανταπόκρισης της νόσου στη θεραπεία 2ης γραμμής, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση είτε του 5L-GSC, είτε της BRCA1 έκφρασης με την κλινική έκβαση.Συμπεράσματα: Η παρούσα ερευνητική εργασία αναδεικνύει τον προβλεπτικό για την κλινική έκβαση ρόλο ενός νέου, υποσχόμενου, φαρμακογενωμικού βιοδείκτη (5L-GSC) που αντανακλά την ενδο-ογκική, συνδυασμένη μεταγραφική έκφραση των γονιδίων CDA, RRM1, RRM2, dCK και hENT1 και που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί στην εξατομίκευση της χημειοθεραπείας 1ης γραμμής με βάση τη γεμσιταβίνη στον ΜΜΚΠ. Παράλληλα, επικυρώνει και ενισχύει τον αντίστοιχο ρόλο που μπορεί να διαδραματίσει στην ογκολογική κλινική πράξη η μεταγραφική έκφραση του γονιδίου BRCA1. Επιπλέον, καταγράφει για πρώτη φορά την παρουσία εκλεκτικής, συνεργικής αλληλεπίδρασης των δύο προτεινόμενων βιοδεικτών στους ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με πλατινούχους συνδυασμούς της γεμσιταβίνης.Παρά τους περιορισμούς της μελέτης λόγω κυρίως του αναδρομικού σχεδιασμού της και του σχετικά μικρού μεγέθους του δείγματος, η σημαντικότητα και εγκυρότητα των ευρημάτων που αφορούν στην προβλεπτική ικανότητα των δύο υποψήφιων βιοδεικτών ενισχύεται από την προοπτική καταγραφή των κλινικών δεδομένων στα πλαίσια κλινικών δοκιμών, την τυποποιημένη εργαστηριακή επεξεργασία των δειγμάτων και τη διενέργεια εκτενούς στατιστικής ανάλυσης που συμπεριέλαβε πολυπαραγοντικές δοκιμασίες, έλεγχο για ενδεχόμενη συσχέτιση των ανεξάρτητων παραμέτρων, μεθοδολογία διασταυρούμενης (εσωτερικής) επικύρωσης και στάθμιση του φαινομένου της υπερπροσαρμογής.