Studies on the bioavailability and pharmacokinetics of EGF-conjugates in breast and non-small cell lung cancer

Abstract

Despite years of research, cancer still represents one of the most challenging and difficult diseases to treat. Extensive research has resulted in the evolution of cancer treatment based on relatively nonspecific cytotoxic agents towards more selective, mechanism-based therapeutics. Cancer chemotherapies were initially identified through screens for compounds that killed rapidly dividing cells. These drugs remain the backbone of current treatment, but they are limited by a narrow therapeutic index, significant toxicities, poor pharmacokinetic properties and frequently acquired resistance. Recently, an improved understanding of cancer pathogenesis has given rise to new treatment options, including targeted agents and cancer immunotherapy. Non-small cell lung cancer (NSCLC) is characterized by high mortality rates, as it is responsible for approximately 85% of all lung cancers. Similarly, breast cancer (BrCa) is the second most commonly diagnosed cancer in Western Europe and the most frequent cause of death from cancer in women, accounting for 91.000 deaths per year. Molecular profiling of BrCa and NSCLC has indicated key proteins, which have been involved in signaling pathways that are commonly activated in many physiological responses such as growth factor receptor tyrosine kinases (RTKs). A widely known RTK with important role in the pathogenesis of human cancer is the epidermal growth factor receptor (EGFR). EGFR has been found to be overexpressed in more than 65% of NSCLCs cases. In breast cancer, approximately 18% of patients are EGFR positive, with 25% of these patients showing HER2 overexpression that has been related with poor prognosis and disease recurrence. The correlation of these two cancer types with EGFR presents an opportunity for the development of improved therapeutic approaches for targeted therapy of BrCa and NSCLC. The main scientific research aim of the current thesis was the evaluation of novel compounds based on two strategies. The first strategy was focused in the design and synthesis of peptide drug conjugates (PDCs) that target the epidermal growth factor receptor EGFR (HER1 for NSCLC and HER2 for BrCa) with primary aim of improving the overall antitumor activity. This was achieved by conjugating ligands that target the EGFR through appropriate linkers to anticancer drugs (Gemcitabine, Sunitinib) of varying therapeutic potential approved for the treatment of BrCa and NSCLC. The PDCs were evaluated in terms of physicochemical properties and in vitro effects. EGF-gemcitabine conjugates were studied in terms of cytotoxicity, in vitro stability and cellular and metabolite formation in different breast and non-small cell lung cancer cell lines. All of the conjugates (H1P1SG, H1P2SG and H2P1SG) tested displayed good antiproliferative activity. H1P2SG was the most potent among them especially, in the breast cancer cell line MDA-MB-231 (IC50=576 nM) compared to gemcitabine (IC50=489 nM). This conjugate also displayed good cellular uptake profile compared with gemcitabine in the NSCLC cancer cell line A549 thus representing a good candidate for further in vivo studies. EGF-sunitinib conjugates were studied in terms of cytotoxicity in different BrCa and NSCLC cell lines. The conjugates (H2P1SS and H2P1RSS) tested displayed good antiproliferative activity. H2P1SS was the most potent among them especially, in the breast cancer cell line HCC-1954 (IC50=18 nM) compared to sunitinib (IC50=14 nM), thus representing a good candidate for further in vitro and in vivo studies. SAP is a new linkable sunitinib analogue and has many advantages over the original molecule including improved solubility and enhanced pharmacokinetic parameters. In addition, experimental studies have shown that SAP retains cytotoxic and antiangiogenic properties of the parental molecule with increased tumor accumulation compared to sunitinib. SAP can provide access to targeting peptide-drug conjugates employing a series of cleavable linkers. Study of the model SAP compounds with cleavable disulphide (SAP-S-S-Py) or dipeptide linkers (i.e. Val-Cit) showed that release of SAP could be achieved in vivo in such a peptide-drug conjugate through the use of such cleavable linkers. A series of SAP conjugates with HER-1 and HER-2 targeting peptides were then synthesized. The second strategy was based on the design and synthesis of novel substituted purine isosters, as potential EGFR inhibitors. Novel substituted purine isosters, were rationally designed through bioisosteric replacement of the central quinazoline core of lapatinib, an approved drug that inhibits both EGFR and HER2, another important member of this family of receptors. The new target molecules were evaluated as inhibitors of receptor phosphorylation at the cellular level, for their direct inhibitory action on the intracellular receptor kinase domain and for their cytotoxicity against the NSCLC cell line A549 and breast cancer HCC1954, cell lines which are associated with overexpression of EGFR and HER2, respectively. The most potent derivatives were further studied for their cellular uptake levels and in vivo pharmacokinetic properties. One lapatinib analogue, compound (23) displayed a noteworthy pharmacokinetic profile, and higher intracellular accumulation in comparison to lapatinib in the A549 cells, possibly due to its higher lipophilicity. This lead compound (23) was assessed for its efficacy in an EGFR positive xenograft model, where it successfully inhibited tumor growth, with a similar efficacy with that of lapatinib. The two novel therapeutic strategies developed in the current thesis will give the opportunity to a number of compounds to be used as alternative treatments via the targeting of EGFR leading to valuable insights associated with BrCa and NSCLC treatment and possibly improvement for the therapeutic options of BrCa and NSCLC patients.

Παρά τα χρόνια έρευνας, ο καρκίνος εξακολουθεί να αποτελεί μία από τις πιο δύσκολες ασθένειες για θεραπεία. Η εκτεταμένη έρευνα έχει οδηγήσει στην εξέλιξη της θεραπείας του καρκίνου με βάση στοχευμένες και μη τοξικές θεραπείες. Οι χημειοθεραπείες του καρκίνου αρχικά βασίστηκαν σε ουσίες που σκότωναν ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. Αυτά τα φάρμακα παραμένουν η ραχοκοκαλιά της τρέχουσας θεραπείας, αλλά περιορίζονται από ένα στενό θεραπευτικό δείκτη, σημαντικές τοξικότητες, προβληματικές φαρμακοκινητικές ιδιότητες και ενώ συχνά οι ασθενείς αναπτύσσουν αντίσταση έναντι των συγκεκριμένων φαρμάκων. Πρόσφατα, μια καλύτερη κατανόηση της παθογένειας του καρκίνου έχει δώσει νέες θεραπευτικές επιλογές, συμπεριλαμβανομένων των στοχευμένων θεραπειών και της ανοσοθεραπείας του καρκίνου. Ο µη-µικροκυταρρικός καρκίνος του πνεύµονα (NSCLC) χαρακτηρίζεται από υψηλά ποσοστά θνησιµότητας καθώς είναι υπεύθυνος για το 85% των συνολικών περιπτώσεων καρκίνου του πνεύµονα. Παροµοίως, ο καρκίνος του µαστού (BrCa) είναι ο δεύτερος πιο συνήθης καρκίνος στη Δυτική Ευρώπη και είναι υπεύθυνος για 91.000 θανάτους το χρόνο. To μοριακό προφίλ του BrCa και NSCLC έχει δείξει βασικές πρωτεΐνες, οι οποίες εμπλέκονται σε μονοπάτια σηματοδότησης που συνήθως ενεργοποιούνται σε πολλές φυσιολογικές αποκρίσεις όπως οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (RTKs). Ένα ευρέως γνωστός RTK με σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου είναι ο υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR). Ο EGFR υπερεκφράζεται σε ποσοστό περισσότερο από 65% των περιπτώσεων NSCLC. Αντίστοιχα, στον καρκίνο του µαστού 18% των ασθενών είναι θετικοί στον EGFR και από αυτούς το 25% παρουσιάζουν υπερέκφραση του HER2 υποδοχέα ο οποίος σχετίζεται µε δυσχερή πρόγνωση και συχνότερη επανεµφάνιση. Αυτή η συσχέτιση των δύο µορφών καρκίνου µε τον υποδοχέα EGFR παρουσιάζει ενδιαφέρουσες προοπτικές για την ανάπτυξη βελτιωµένων θεραπευτικών προσεγγίσεων για την στοχευµένη θεραπεία του BrCa και του NSCLC. Ο στόχος της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής ήταν η αξιολόγηση νέων ενώσεων βάση δύο στρατηγικών. Η πρώτη θεραπευτική προσέγγιση βασίστηκε στην σύνθεση συµπλόκων χηµειοθεραπευτικών φαρµάκων µε πεπτίδια τα οποία στοχεύουν ειδικά τον επιδερµικό αυξητικό παράγοντα EGFR (τον ΗΕR1 για το NSCLC και ΗΕR2 για τον BrCa) με πρωταρχικό στόχο τη βελτίωση της συνολικής αντικαρκινικής δράσης. Η σύνθεση επιτεύχθηκε µε την σύζευξη κατάλληλων προσδετών (ligands) του EGFR µε αντικαρκινικά φάρµακα που ήδη χρησιµοποιούνται για την κλινική πράξη (γεμσιταβίνη, σουνιτινίμπη), µέσω κατάλληλων συνδετών. Τα σύµπλοκα χηµειοθεραπευτικών φαρµάκων µε πεπτίδια αξιολογήθηκαν ως προς τις φυσικοχηµικές ιδιότητές τους και τις επιδράσεις τους in vitro. Τα θεραπευτικά συζεύγματα EGF-γεμσιταβίνης μελετήθηκαν όσον αφορά την κυτταροτοξικότητα τους, τη σταθερότητα τους και μεταβολισμό σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Συνοψίζοντας τα αποτελέσµατα των µελετών δραστικότητας των τριών συµπλόκων H1P1SG, H2P1SG και H1P2SG έναντι του αντικαρκινικού φαρµάκου γεµσιταβίνης µπορεί να εξαχθεί το συµπέρασµα ότι τα µόρια αυτά έχουν αξιόλογη αντικαρκινική δράση στις καρκινικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Το σύµπλοκο H1P2SG, έδειξε την καλύτερη αποτελεσματικότητα με παρόµοια δραστικότητα µε τη γεµσιταβίνη στην καρκινική σειρά του µαστού MDA-MB-231 καθώς η τιµή IC50 ήταν 567 nM (±90) ενώ της γεµσιταβίνης 489 nM (±186). Το συγκεκριμένο μόριο έδειξε επίσης καλό προφίλ κυτταρικής πρόσληψης σε σύγκριση με τη γεμσιταβίνη στη κυτταρική σειρά A549 του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και αποτελεί ένα καλό μόριο με προοπτικές για περαιτέρω in vivo μελέτες. Τα θεραπευτικά συζεύγματα EGF-σουνιτινίμπης επίσης μελετήθηκαν όσον αφορά την κυτταροτοξικότητα τους. Συνοψίζοντας τα αποτελέσµατα των µελετών δραστικότητας των δύο συµπλόκων H2P1SS και H2P1RSS έναντι του αντικαρκινικού φαρμάκου σουνιτινίμπης µπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι τα µόρια αυτά έχουν αξιόλογη αντικαρκινική δράση στις καρκινικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Το σύµπλοκο H2P1SS έδειξε την καλύτερη αποτελεσματικότητα καθώς είχε παρόμοια δραστικότητα µε τη σουνιτινίμπη στην καρκινική σειρά του µαστού HCC-1954 με τιµή IC50 για το H2PSS ήταν 18 nM (±1) ενώ της σουνιτινίμπης ήταν 14 nM (±6). Το SAP είναι ένα νέο ανάλογο του αντικαρκινικού φαρμάκου σουνιτινίμπη με πολλά πλεονεκτήματα έναντι του αρχικού μορίου, όπως η βελτιωμένη διαλυτότητα και οι ενισχυμένες φαρμακοκινητικές ιδιότητες. Επιπλέον, πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι το SAP διατηρεί τις κυτταροτοξικές και αντιαγγειογόνες ιδιότητες του αρχικού μορίου με αυξημένη συσσώρευση όγκου σε σύγκριση με το sunitinib. Συζεύγματα του SAP σχεδιάσθηκαν και συντέθηκαν για την εκπόνηση της συγκεκριμένης διατριβής. Αυτό που καθιστά τo SAP να είναι ξεχωριστό και ενδιαφέρον είναι ότι μπορεί να δώσει πρόσβαση σε στοχευτικά συζεύγματα μέσω σύζευξής του με βιοδιασπώμενες γέφυρες, κάτι στο οποίο το γονικό μόριο σουνιτινίμπη υστερεί. Μελέτη πρότυπων ενώσεων του SAP με γέφυρες δισουλφιδικής ή διπεπτιδικής (π.χ. Val-Cit) φύσεως έδειξε ότι θα μπορούσε να επιτευχθεί in vivo η απελευθέρωση του SAP από στοχευτικά συζεύγματα με τη χρήση των παραπάνω γεφυρών. Στη συνέχεια, συντέθηκαν συζεύγματα του SAP με πεπτίδια που στοχεύουν τόσο τον υποδοχέα HER-1 όσο και τον HER-2, υποδοχείς που ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των EGFR υποδοχέων. Η δεύτερη στρατηγική βασίστηκε στο σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων υποκατεστημένων ισοστερών πουρίνης, ως δυνητικοί αναστολείς του EGFR. Οι ενώσεις σχεδιάστηκαν ορθολογικά με βιοϊσοστερική αντικατάσταση του κεντρικού πυρήνα κινναζολίνης του lapatinib, ενός εγκεκριμένου φαρμάκου που αναστέλλει τόσο τον EGFR όσο και τον HER2, ένα άλλο σημαντικό μέλος αυτής της οικογένειας υποδοχέων. Τα νέα μόρια στόχοι αξιολογήθηκαν ως αναστολείς της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα σε κυτταρικό επίπεδο για την άμεση ανασταλτική τους δράση στην ενδοκυτταρική περιοχή της κινάσης του υποδοχέα και για την κυτταροτοξικότητά τους έναντι της κυτταρικής σειράς Α549 μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του μαστού HCC1954, που σχετίζονται με την υπερέκφραση του EGFR και του HER2 αντίστοιχα. Τα πιο αποτελεσματικά ανάλογα μελετήθηκαν περαιτέρω για τα επίπεδα κυτταρικής πρόσληψης και τις in vivo φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες. Ένα μόριο (23) εμφάνισε αξιοσημείωτο φαρμακοκινητικό προφίλ και υψηλότερη ενδοκυτταρική πρόσληψη σε σύγκριση με το lapatinib στα κύτταρα Α549, πιθανώς λόγω της υψηλότερης λιποφιλικότητάς του. Αυτό το μόριο (23) αξιολογήθηκε ως προς την αποτελεσματικότητά του σε ένα ζωικό μοντέλο ξενομοσχεύματος EGFR, όπου ανέστειλε επιτυχώς την ανάπτυξη του όγκου με παρόμοια αποτελεσματικότητα με εκείνη του φαρμάκου lapatinib. Οι δύο νέες θεραπευτικές στρατηγικές, που αναπτύχθηκαν στην παρούσα εργασία, θα δώσουν την ευκαιρία σε έναν αριθμό νέων ενώσεων, αντικαρκινικών μορίων, να χρησιμοποιηθούν ως εναλλακτικές θεραπείες για BrCa και NSCLC μέσω της στόχευσης του EGFR. Τέλος, υπάρχει το ενδεχόμενο να επιτευχθεί βελτίωση για τις θεραπευτικές επιλογές των BrCa και NSCLC.