Μελέτη της επίδρασης της μεταμόσχευσης εντερικής μικροχλωρίδας και των κορτικοειδών στην επάρκεια του βλεννογόνιου εντερικού φραγμού, τη συστηματική φλεγμονώδη απάντηση και τη θνητότητα σε πειραματικό μοντέλο πολυμικροβιακής σήψης σε επίμυες

Abstract

Introduction: Sepsis is a life-threatening syndrome which can progress to multiple organ dysfunction with high mortality. Intestinal barrier failure exerts a central role in the pathophysiological sequence of events that lead from sepsis to multiple organ dysfunction. The present study investigated the role of hydrocortisone (HC) administration and fecal microbiota transplantation (FMT) in several parameters of the gut barrier integrity, immune activation and survival, in a model of polymicrobial sepsis in rats. Methods: Forty adults male Wistar rats were randomly divided into four groups: sham (group I), cecal ligation and puncture (CLP) (group II), CLP + HC (2.8 mg/kg, intraperitoneally single dose at 6 hours) (group III) and CLP + FMT at 6 hours (group IV). At 24h post-CLP, ileal tissues were harvested for histological and immunohistochemical analyses while endotoxin, IL-6 and IL-10 levels in systemic circulation were determined. In a second experiment the same groups were observed for seven days for mortality, with daily administration of hydrocortisone (group III) and FMT (group IV) in surviving rats. Results: HC administration and FMT significantly reduced mortality of septic rats by 50%. These interventions totally reversed intestinal mucosal atrophy by increasing villous density and mucosal thickness (μm, mean±SD: Group I: 620±35, Group II: 411±52, Group III: 622±19, Group IV: 617±44). HC and FMT reduced the apoptotic body count in intestinal crypts whereas increased the mitotic/apoptotic index. Activated caspase-3 expression in intestinal crypts was significantly reduced by HC or FMT (activated caspase-3 (+) enterocytes/10 crypts, mean±SD: Group I: 1,6±0,5, Group II: 5,8±2,4, Group III: 3,6±0,9, Group IV:2,3±0,6). Both treatments increased Paneth cell count and decreased intraepithelial CD3 (+) T lymphocytes and inflammatory infiltration of lamina propria to control levels. In the sham group almost the total of intestinal epithelial cells expressed occludin (92±8%) and claudin-1 (98±4%) and CLP reduced this expression to 34±12% for occludin and 35±7% for claudin-1. Administration of HC significantly increased occludin (51±17%) and claudin-1 (77±9%) expression. FMT exerted also a significant restoring effect in TJ by increasing occludin (56±15%) and claudin-1 (84±7%) expression. The beneficial effects of these treatments on gut barrier function led to significant reduction of systemic endotoxemia (EU/ml, mean±SD: Group I: 0,93±0,36, Group II: 2,14±1,74, Group III: 1,48±0,53, Group IV: 1,61±0,58,), while FMT additionally decreased IL-6 and IL-10 levels. Conclusion: Fecal microbiota transplantation and stress dose hydrocortisone administration in septic rats induce a multifactorial improvement of the gut mechanical and immunological barriers, preventing endotoxemia and leading to improved survival.

Εισαγωγή: Η σήψη αποτελεί ένα απειλητικό για τη ζωή σύνδρομο, που μπορεί να εξελιχθεί σε πολυοργανική ανεπάρκεια με υψηλή θνητότητα. Η ανεπάρκεια του εντερικού φραγμού διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην παθοφυσιολογική αλληλουχία των γεγονότων που οδηγούν από τη σήψη στην πολυοργανική ανεπάρκεια. Η παρούσα μελέτη ερευνά τον ρόλο της χορήγησης υδροκορτιζόνης (HC) και της μεταμόσχευσης εντερικής μικροχλωρίδας (FMT), σε ορισμένες παραμέτρους της ακεραιότητας του εντερικού φραγμού, στην ενεργοποίηση του συστήματος ανοσίας και στην επιβίωση, σε ένα μοντέλο πολυμικροβιακής σήψης σε επίμυες. Μεθοδολογία: Σαράντα ενήλικοι αρσενικοί επίμυες τύπου Wistar χωρίστηκαν με τυχαιοποιημένο τρόπο σε τέσσερεις ομάδες: ομάδα ελέγχου (ομάδα Ι), ομάδα απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού (CLP) (ομάδα ΙΙ), ομάδα απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού με χορήγηση υδροκορτιζόνης (2.8 mg/kg, μια δόση ενδοπεριτοναϊκά μετά παρέλευση 6ώρου) (CLP+HC) (ομάδα ΙΙΙ) και ομάδα απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού με μεταμόσχευση εντερικής μικροχλωρίδας (μετά παρέλευση 6ώρου) (CLP+FMT) (ομάδα IV). Στις 24 ώρες μετά την απολίνωση και διάτρηση του τυφλού, ελήφθησαν δείγματα ειλεού από τα πειραματόζωα προς ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική μελέτη, και μετρήθηκαν τα επίπεδα ενδοτοξίνης, ιντερλευκίνης-6 και ιντερλευκίνης-10 στη συστηματική κυκλοφορία. Σε ένα δεύτερο πείραμα, οι ίδιες ομάδες παρακολουθήθηκαν για επτά ημέρες και καταγράφηκε η θνητότητα, με καθημερινή χορήγηση υδροκορτιζόνης (ομάδα ΙΙΙ) και μεταμόσχευση εντερικής μικροχλωρίδας (ομάδα IV) στα πειραματόζωα που επιβίωναν. Αποτελέσματα: Η χορήγηση υδροκορτιζόνης και η μεταμόσχευση εντερικής μικροχλωρίδας ελάττωσαν τη θνητότητα στα πειραματόζωα με σήψη κατά 50%. Οι παρεμβάσεις αυτές ανέστρεψαν πλήρως την ατροφία του εντερικού βλεννογόνου, αυξάνοντας την πυκνότητα των εντερικών λαχνών και το πάχος του βλεννογόνου (σε μm, μέση τιμή±τυπική αποκλιση (SD): Ομάδα I: 620±35, Ομάδα II: 411±52, Ομάδα III: 622±19, Ομάδα IV:617±44). Η HC και η FMT ελάττωσαν τον αριθμό των αποπτωτικών σωματίων στις εντερικές κρύπτες, ενώ αύξησαν τον μιτωτικό/αποπτωτικό δείκτη. Η έκφραση της ενεργοποιημένης μορφής της κασπάσης-3 στις εντερικές κρύπτες ελαττώθηκε σημαντικά από τη χορήγηση HC και από την FMT (κασπάση-3 (+) εντεροκύτταρα/10 κρύπτες, μέση τιμή±SD: Ομάδα I: 1,6±0,5, Ομάδα II: 5,8±2,4, Ομάδα III: 3,6±0,9, Ομάδα IV:2,3±0,6). Αμφότερες οι θεραπείες αύξησαν τον αριθμό των κυττάρων Paneth και ελάττωσαν τα ενδοεπιθηλιακά CD3(+) T λεμφοκύτταρα και τη φλεγμονώδη διήθηση στο χόριο στα επίπεδα της ομάδας ελέγχου. Στην ομάδα ελέγχου, η έκφραση της occludin και της claudin-1 παρατηρήθηκε περίπου στο σύνολο των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων (92±8% και 98±4% αντίστοιχα), ενώ στην ομάδα ΙΙ (CLP) ελαττώθηκε η έκφρασή τους στο 34±12% για την occludin και στο 35±7% για την claudin-1. Η χορήγηση HC αύξησε σημαντικά την έκφραση της occludin (51±17%) και της claudin-1 (77±9%). Η FMT επίσης αποκατέστησε σημαντικά τις TJs αυξάνοντας την έκφραση της occludin (56±15%) και της claudin-1 (84±7%). Τα ευεργετικά οφέλη αυτών των θεραπειών στη λειτουργία του εντερικού φραγμού οδήγησαν σε σημαντική ελάττωση της συστηματικής ενδοτοξιναιμίας (σε EU/ml, μέση τιμή±SD: Ομάδα I: 0,93±0,36, Ομάδα II: 2,14±1,74, Ομάδα III: 1,48±0,53, Ομάδα IV: 1,61±0,58), ενώ η FMT ελάττωσε επιπλέον τα επίπεδα της IL-6 και της IL-10. Συμπεράσματα: Η μεταμόσχευση εντερικής μικροχλωρίδας και η χορήγηση υδροκορτιζόνης σε δόση stress σε επίμυες με σήψη, προκαλούν μια πολυπαραγοντική βελτίωση του μηχανικού και ανοσολογικού φραγμού του εντέρου, προλαμβάνοντας την ενδοτοξιναιμία και οδηγώντας σε βελτίωση της επιβίωσης.