Ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων και μελέτες μετάδοσης σφαλμάτων

Abstract

The main contribution of the present PhD thesis to the Analytical Chemistry of Nucleic Acids lies in the development of optical methods for the identification and quantification of specific nucleic acid sequences whose key methodological characteristics are simplicity, speed and low cost of analysis. The thesis focuses on the introduction of the mobile phone and the digital camera as new detectors/imagers for quantitative chemiluminometric assays of nucleic acids as well as the exploitation of colored nanoparticles for the development of optical DNA biosensors with applications in rapid liquid biopsy. Moreover, error propagation studies in nucleic acid analyses were carrying out in the context of the present PhD thesis.Chapter 1 reviews the literature on the use of enzymes as labels, in combination with chemiluminogenic substrates, for nucleic acid analyses. Chapter 2 presents different classes of optical nucleic acid sensors with emphasis on their operating principles and applications. Nanoparticles have an important role to play as labels in modern biosensors. Chapter 3 refers specifically to gold nanoparticles, covering the methods of their synthesis methods and their excellent optical properties.The subject of Chapter 4 is the construction of calibration curves in analytical chemistry, in particular linear fitting using the least squares method and the requirements for its application. The Experimental Part of the Thesis consists of Chapters 5-9. In Chapter 5, the mobile phone (smartphone) is introduced as a new chemiluminescence reader/imager with application to the development of DNA hybridization assays. The research work is centered on the hybridization assay. A specific probe sequence is immobilized in microtiter wells and hybridized with a biotinylated and denatured target DNA. The detection of hybrids is achieved by the addition of an avidin-peroxidase conjugate in combination with a chemiluminogenic substrate. The chemiluminescence is measured with a common smartphone. In addition, a digital camera and a luminometer are used as detectors, for comparison. Extensive studies were carried out to optimize the acquisition and processing conditions of the images taken by the smartphone and the digital camera. Chapter 6 describes the development of a quantitative competitive polymerase chain reaction (QCPCR) method using the smartphone and the digital camera as chemiluminescence imagers. For QCPCR, a suitable DNA competitor was synthesized that has the role of an internal standard (IS) for quantification. In each amplification reaction, a constant amount (5000 molecules) of the competitor, which has the same size and primer binding sites as the target DNA, are added. The products of simultaneous amplification of the competitor and the target sequence are quantified by hybridization. The ratio of chemiluminescence signals obtained from the smartphone and the digital camera for the target and the competitor is a function of the number of the target DNA copies in the sample prior to PCR amplification. The analytical performance of the smartphone- and digital camera-based methods was evaluated and compared to the luminometer.Chapter 7 discusses the development of a DNA biosensor, a dry reagent strip-type diagnostic strip, based on gold nanoparticles for applications in rapid liquid biopsy. The application methodology includes: i) isolation of DNA from control cell lines or isolation of cell-free DNA (cfDNA) from blood’s plasma, ii) amplification by polymerase chain reaction (PCR), iii) primer extension reaction for allele discrimination, and iv) detection of the products with the DNA biosensor. A study to optimize the sensor using synthetic DNA targets as well as model cancer lines was carried out. Finally, the biosensor was applied to clinical samples of patients and healthy individuals to discriminate KRAS gene mutations associated with colorectal cancer (CRC) in circulating cancer DNA (ctDNA).In Chapter 8 a rapid multiplex molecular strip test for KRAS gene genotyping with optical detection and applications in rapid, non-invasive, liquid biopsy was developed. The diagnostic strip test - DNA biosensor, based on gold nanoparticles for optical detection, was applied to the simultaneous discrimination of KRAS gene point mutations in ctDNA. The rapid multiplex assay was then applied to tissue samples from colorectal cancer patients and finally to cfDNA derived from blood samples of healthy individuals and patients with advanced CRC.The present PhD thesis is completed with Chapter 9, which reports error propagation studies on microRNA analysis. MicroRNAs are small RNA sequences that have been linked to various types of cancer in recent years and are emerging biomarkers for the diagnosis and monitoring of cancer and other diseases. Calibration data were collected from 100 published analytical methods to conduct these studies. The methods were categorized, based on their calibration curve, into linear or logarithmic concentration scale. The study was focused on the propagation of uncertainty, microRNA concentration and the estimation of the minimum distinguishable change in concentration (MDC), which is statistically discrete, using appropriate mathematical models.

Η συμβολή της παρούσας διδακτορικής διατριβής στην Αναλυτική Χημεία των Νουκλεϊκών Οξέων έγκειται στην ανάπτυξη οπτικών μεθόδων ταυτοποίησης και ποσοτικού προσδιορισμού ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων με κύρια μεθοδολογικά χαρακτηριστικά την απλότητα και ταχύτητα στην εκτέλεσή τους καθώς και το χαμηλό κόστος ανάλυσης. Η διατριβή επικεντρώνεται στην αξιοποίηση του κινητού τηλεφώνου και της ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής ως νέων ανιχνευτών για ποσοτικές χημειοφωταυγειομετρικές αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων καθώς και στην αξιοποίηση έγχρωμων νανοσωματιδίων για την ανάπτυξη οπτικών βιοαισθητήρων DNA με εφαρμογές στην ταχεία υγρή βιοψία. Επιπλέον, στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η διάδοση των σφαλμάτων στις αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων.Το Θεωρητικό Μέρος αποτελείται από τα Κεφάλαια 1-4. Στο Κεφάλαιο 1 ανασκοπείται η βιβλιογραφία που αφορά στην αξιοποίηση των ενζύμων ως ιχνηθετών, σε συνδυασμό με χημειοφωταυγειογόνα υποστρώματα, για αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων. Στο Κεφάλαιο 2 παρουσιάζονται διάφορες κατηγορίες οπτικών αισθητήρων νουκλεϊκών οξέων με έμφαση στις αρχές λειτουργίας και τις εφαρμογές τους. Τα νανοσωματίδια έχουν σημαντικό ρόλο ως ιχνηθέτες στους σύγχρονους βιοαισθητήρες. Το Κεφάλαιο 3 αναφέρεται ειδικά στα νανοσωματίδια χρυσού, στις μεθόδους σύνθεσής τους καθώς και στις εξαιρετικές οπτικές τους ιδιότητες.Αντικείμενο του Κεφαλαίου 4 είναι τα διαγράμματα βαθμονόμησης στην αναλυτική χημεία και ιδιαίτερα η γραμμική προσαρμογή με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων και οι προϋποθέσεις που ισχύουν για την εφαρμογή της. Το Πειραματικό Μέρος της διατριβής αποτελείται από τα Κεφάλαια 5-9. Στο Κεφάλαιο 5, το κινητό τηλέφωνο (smartphone) εισάγεται ως νέος ανιχνευτής χημειοφωταύγειας με εφαρμογή στην ανάπτυξη μεθόδων υβριδοποίησης DNA. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη δοκιμασία υβριδοποίησης. Ειδική αλληλουχία ανιχνευτής ακινητοποιείται σε φρεάτια πλακιδίων μικτροτιτλοδότησης και υβριδοποιείται με έναν βιοτινυλιωμένο και αποδιαταγμένο DNA-στόχο. Ο προσδιορισμός των υβριδίων πραγματοποιείται με την προσθήκη συζεύγματος αβιδίνης-υπεροξειδάσης σε συνδυασμό με χημειοφωταυγειογόνο υπόστρωμα. Η εκπεμπόμενη ακτινοβολία ανιχνεύεται με ένα κοινό smartphone. Επιπλέον ως ανιχνευτές χρησιμοποιούνται μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και το λουμινόμετρο για σύγκριση. Πραγματοποιήθηκαν εκτενείς μελέτες για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών λήψης και επεξεργασίας των εικόνων που λήφθηκαν από τους δύο ανιχνευτές. Στο Κεφάλαιο 6 περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Quantitative Competitive PCR, QCPCR) χρησιμοποιώντας το smartphone ως ανιχνευτή χημειοφωταύγειας. Για την QCPCR συντέθηκε κατάλληλος ανταγωνιστής DNA που έχει το ρόλο εσωτερικού προτύπου (Internal Standard, IS). Σε κάθε αντίδραση ενίσχυσης προστίθενται 5000 μόρια του ανταγωνιστή, ο οποίος έχει το ίδιο μέγεθος και τις ίδιες θέσεις πρόσδεσης εκκινητών με το DNA στόχο. Τα προϊόντα ταυτόχρονης ενίσχυσης του ανταγωνιστή και του μορίου στόχου προσδιορίζονται ποσοτικά μέσω υβριδοποίησης. Η αναλογία των σημάτων χημειοφωταύγειας που λαμβάνονται από το smartphone συσχετίζονται με τον αριθμό των αντιγράφων του DNA στόχου στο δείγμα πριν από την ενίσχυση με PCR. Η μέθοδος αξιολογήθηκε ως προς τις αναλυτικές της επιδόσεις σε σύγκριση με το λουμινόμετρο και την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή.Το Κεφάλαιο 7 πραγματεύεται την ανάπτυξη βιοαισθητήρα DNA, τύπου διαγνωστικής ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, βασισμένου σε νανοσωματίδια χρυσού για εφαρμογές στην ταχεία υγρή βιοψία. Η μεθοδολογία εφαρμογής περιλαμβάνει: i) απομόνωση DNA από πρότυπες κυτταρικές σειρές ή απομόνωση ελεύθερου εξωκυττάριου (cell-free) DNA (cfDNA) από πλάσμα αίματος, ii) ενίσχυση μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), iii) αντίδραση επέκτασης εκκινητή για την διάκριση των αλληλίων και iv) ανίχνευση των προϊόντων με τον βιοαισθητήρα DNA. Πραγματοποιήθηκε μελέτη βελτιστοποίησης του αισθητήρα με τη χρήση συνθετικών DNA-στόχων καθώς και πρότυπων καρκινικών σειρών. Τέλος, έγινε εφαρμογή του βιοαισθητήρα σε κλινικά δείγματα ασθενών και υγιών ατόμων για τη διάκριση μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS, που σχετίζονται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, σε κυκλοφορούν καρκινικό DNA (ctDNA).Στο Κεφάλαιο 8 αναπτύχθηκε ένα γρήγορο πολυαναλυτικό μοριακό τεστ για τη γονοτύπηση του γονιδίου KRAS με οπτική ανίχνευση και εφαρμογές σε ταχεία, μη επεμβατική, υγρή βιοψία. Το διαγνωστικό τεστ-βιοαισθητήρας DNA, βασισμένο σε νανοσωματίδια χρυσού για οπτική ανίχνευση, εφαρμόστηκε στην ταυτόχρονη ταυτοποίηση σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου KRAS σε ctDNA. Το γρήγορο πολλαπλό τεστ εφαρμόστηκε στη συνέχεια σε δείγματα ιστού από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και τέλος σε cfDNA που προερχόταν από δείγματα αίματος υγιών ατόμων και ασθενών με προχωρημένη νόσο CRC.Η παρούσα διδακτορική διατριβή ολοκληρώνεται με το Κεφάλαιο 9, το οποίο αφορά στις μελέτες μετάδοσης σφαλμάτων σε προσδιορισμούς microRNA. Τα microRNAs είναι μικρές αλληλουχίες RNA, οι οποίες έχουν συνδεθεί με διάφορα είδη καρκίνου τα τελευταία χρόνια και αποτελούν υποσχόμενους βιοδείκτες διάγνωσης και παρακολούθησης του καρκίνου και άλλων ασθενειών. Για τη διεξαγωγή της μελέτες συλλέχθηκαν 100 δημοσιευμένες αναλυτικές μέθοδοι από τις οποίες χρησιμοποιήθηκαν τα δεδομένα βαθμονόμησης. Οι μέθοδοι κατηγοριοποιήθηκαν, με βάση την καμπύλη βαθμονόμησης που παρουσίαζαν, σε γραμμική ή λογαριθμική κλίμακα συγκεντρώσεων. Η μελέτη επικεντρώθηκε στη μετάδοση της αβεβαιότητας, στην συγκέντρωση των microRNA αλλά και στην εκτίμηση της ελάχιστης μεταβολής της συγκέντρωσης (MDC), που είναι στατιστικώς διακριτή, με τη βοήθεια των κατάλληλων μαθηματικών μοντέλων.