Σύνθετα νανο-βιοκεραμικά / πολυμερικά ικριώματα για οστική αναγέννηση: σύνθεση και μελέτη δομικών και μηχανικών ιδιοτήτων

Abstract

The treatment of choice of bone defects with the transplantation of autologous graft has many problems such as painful surgeries and necrosis or graft failure caused by insufficient vascularization within the graft. In addressing these issues, bone tissue engineering with 3D scaffolds and modern developments in regenerative medicine provide the appropriate framework for the formation of new functional tissues.Thus, the aim of the present PhD thesis was the fabrication of bioactive polymeric–ceramic hybrid scaffolds focused on the enhancement of osteogenesis and angiogenesis, using mesoporous nanocarriers for the development of local drug delivery systems to prolonged and sustained release of drugs in-vitro or nano-fillers to obtain enhanced mechanical properties.The present doctoral dissertation titled " Hybrid polymeric/nano-ceramic scaffolds for bone tissue regeneration: Synthesis and investigation of structural and mechanical properties" was held at the Advanced Materials and Devices Laboratory (AMDeLab) of the Department of Physics of the Aristotle University of Thessaloniki. In this dissertation the study of the synthesis of novel multifunctional hybrid ceramic-based scaffolds or polymeric-ceramic electrospun membranes with emphasis on the neovascularization of the regenerated bone took place. More specifically, the study was divided into two parts, where biomaterials were prepared with "green" low-cost techniques and it was performed the complete structural characterization. Also, in this research the biological response, the ability to encapsulate and release biomolecules and the mechanical properties of the hybrid scaffolds were studied.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή με τίτλο «Σύνθετα Νανο-βιοκεραμικά/Πολυμερικά Ικριώματα για Οστική Αναγέννηση: Σύνθεση και Μελέτη Δομικών και Μηχανικών Ιδιοτήτων» πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Προηγμένων Υλικών και Διατάξεων (AMDeLab) του Τομέα Φυσικής Στερεάς Κατάστασης στο Τμήμα Φυσικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Στην εν λόγω διατριβή έλαβε χώρα η εις βάθος μελέτη της σύνθεσης καινοτόμων πολυλειτουργικών σύνθετων ικριωμάτων ή μεμβρανών συνδυάζοντας μεσοπορώδεις νανοφορείς για την επίτευξη ανάπτυξης συστήματος τοπικής χορήγησης για την παρατεταμένη αποδέσμευση δραστικών ουσιών in-vitro ή τη χρήση νανο-πληρωτικών για την ενίσχυση των μηχανικών ιδιοτήτων τους. Πιο συγκεκριμένα, η μελέτη διαχωρίστηκε σε δύο μέρη, όπου παρασκευάστηκαν βιοϋλικά με «πράσινες» τεχνικές χαμηλού κόστους και πραγματοποιήθηκε ο πλήρης δομικός χαρακτηρισμός τους. Ακόμα, μελετήθηκε η βιολογική τους απόκριση, η ικανότητα ενθυλάκωσης και αποδέσμευσης δραστικών ουσιών και οι μηχανικές τους ιδιότητες. Στο κεφάλαιο 1, πραγματοποιείται μια σύντομη περιγραφή του κλινικού προβλήματος που καλείται να αντιμετωπίσει η μηχανική των ιστών για την αποκατάσταση του οστίτη ιστού. Στη συνέχεια, στο κεφάλαιο 2 πραγματοποιείται η ανάλυση του θεωρητικού υποβάθρου στο οποίο βασίστηκε η παρούσα μελέτη και οι νέες τάσεις της ιστομηχανικής σήμερα, ενώ στο κεφάλαιο 3 πραγματοποιείται η σύντομη περιγραφή των τεχνικών χαρακτηρισμού που ακολουθήθηκαν για την διεκπεραίωση της παρούσας εργασίας.Η περιοδοντίτιδα είναι μια νόσος των περιοδοντικών ιστών με εμφάνιση στο 20-50% του πληθυσμού παγκοσμίως. Αποτελεί μια βακτηριακής προέλευσης καταστροφική φλεγμονώδη κατάσταση που επηρεάζει τους ιστούς που υποστηρίζουν τα δόντια και αποτελεί το σημαντικότερο λόγο πρόωρης απώλειας των δοντιών. Η μηχανική των ιστών που χρησιμοποιεί ικριώματα είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αποκατάσταση των οστικών ελλειμάτων των οστών που προκύπτουν από την περιοδοντίτιδα. Σε αυτόν τον τομέα, μεταξύ πολλών μεθόδων για την παραγωγή νανοϊνών, η ηλεκτροϊνοποίηση (electrospinning) έχει αποκτήσει μια αναδυόμενη δημοτικότητα στην ερευνητική κοινότητα λόγω των αξιοσημείωτων χαρακτηριστικών της, όπως η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας, η ευελιξία και οι τροποποιήσιμες παράμετροι δημιουργίας ινωδών ικριωμάτων. Στο πλαίσιο αυτό, στο πρώτο ειδικό μέρος της διατριβής (κεφάλαιο 4) πραγματοποιείται η περιγραφή και ανάλυση της δημιουργίας πολυλειτουργικών ινωδών ικριωμάτων για την αποκατάσταση των περιοδοντικών βλαβών συνδυάζοντας μεσοπορώδεις νανο-φορείς της δραστικής ουσίας μοξιφλοξασίνης με το συνθετικό συμπολυμερές πολύ(γαλακτικό-γλυκολικό) οξύ (PLGA).Ειδικότερα, αρχικά πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός των μεσοπορωδών νανοφορέων με βάση το διοξείδιο του πυριτίου με την μέθοδο Sol-Gel, οι οποίοι θεωρούνται πολλά υποσχόμενοι φορείς φαρμάκων λόγω της διατεταγμένης δομής των πόρων τους και της υψηλής ικανότητας ενθυλάκωσης και απελευθέρωσης φαρμάκων. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ο εμπλουτισμός των μεσοπορωδών νανοφορέων πυριτίου με ιόντα όπως α) το ασβέστιο, το οποίο σε συνδυασμό με το πυρίτιο έχουν τη δυνατότητα να προάγουν τη οστεογενή διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων προκειμένου να πραγματοποιηθεί η ενασβεστίωση της εξωκυττάριας μήτρας και β) το μαγνήσιο και το στρόντιο τα οποία αποτελούν βασικά στοιχεία της βιολογίας των οστών και του μεταβολισμού. Οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες διερευνήθηκαν με την περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD), την Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) - Φασματοσκοπία Ενεργειακής Διασποράς (EDS), την Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης Υψηλής Ανάλυσης (HRTEM), τη Φασματοσκοπία Υπερύθρων με Μετασχηματισμούς Fourier (FT-IR), τη Φασματοσκοπία Φθορισμού Ακτίνων-Χ (XRF), την Ποροσιμετρία μέσω Προσρόφησης/Εκρόφησης N2 (BET/BJH), τη Δυναμική Σκέδαση Φωτός (DLS), ενώ πραγματοποίησε τον προσδιορισμό του Ζ-Δυναμικού. Ακόμα, αξιολογήθηκε το προφίλ ενθυλάκωσης και απελευθέρωσης της δραστικής ουσίας μοξιφλοξασίνης με την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC), η ζωτικότητα ανθρώπινων ινοβλαστών του περιοδοντικού συνδέσμου και η αιμολυτική τους δράση σε επαφή με ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBCs) σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τα εμπλουτισμένα μεσοπορώδη νανοσωματίδια διατήρησαν τα δομικά χαρακτηριστικά τους, ενώ οι διαφορετικές συστάσεις επηρέασαν το μέγεθος των σωματιδίων, την αιμολυτική τους δραστηριότητα και τα προφίλ ενθυλάκωσης/απελευθέρωσης της μοξιφλοξασίνης (MOX). Επιπλέον ενίσχυσαν το σχηματισμό ανθρακικού απατίτη στην επιφάνειά τους μετά από εμβάπτιση στο υγρό προσομοίωσης των σωματικών υγρών (SBF) και προώθησαν τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι φυσικοχημικές και βιολογικές ιδιότητες των μεσοπορωδών νανοφορέων τα καθιστούν εξαιρετικούς υποψήφιους για εφαρμογές αναγέννησης ιστών ως λειτουργικά πληρωτικά σε σύνθετα πολυμερικά ικριώματα, σε επικαλύψεις στην επιφάνεια μεταλλικών εμφυτευμάτων ή σε ενέσιμα βιοενεργά κεραμικά.Προς αυτήν την οδό, πραγματοποιήθηκε η μελέτη της δημιουργίας και του χαρακτηρισμού σύνθετων πολυλειτουργικών ινωδών ικριωμάτων με την τεχνική της ηλεκτροϊνοποίησης συνδυάζοντας τους συντεθειμένους μεσοπορώδεις νανο-φορείς με το συμπολυμερές PLGA. Ειδικότερα, αρχικά για να παραχθούν ινώδεις νανοδομές με βάση το συμπολυμερές PLGA πραγματοποιήθηκε η μελέτη του ποσοστού του πολυμερούς στο διάλυμα και των παραμέτρων δημιουργίας νανοδομών. Έπειτα διενεργήθηκε η μελέτη της διασποράς των μεσοπορωδών νανοφορέων και το ποσοστό προσθήκης αυτών στην πολυμερική μήτρα. Για τον δομικό χαρακτηρισμό των ινωδών ικριωμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές SEM/EDS, FTIR και η Φασματοσκοπία Αποσβένουσας Ολικής Ανάκλασης (ATR). Πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση του προφίλ ενθυλάκωσης της δραστικής ουσίας μοξιφλοξασίνης με την τεχνική FTIR και SEM/EDS, η μελέτη Διόγκωσης και η Ικανότητα Προσρόφησης Διαλύματος, η αξιολόγηση της βιοαποικοδόμησης και η αιμολυτική δράση των ινωδών ικριωμάτων σε επαφή με τα RBCs.Η Ιστομηχανική βρίσκει ολοένα και ευρύτερη εφαρμογή στην αποκατάσταση τόσο των οστικών ελλειμμάτων, όσο και στην ενίσχυση της οστεοενσωμάτωσης ορθοπεδικών/οδοντικών εμφυτευμάτων. Τέτοια ελλείμματα αντιμετωπίζονται συνήθως με αυτόλογα μοσχεύματα, τα οποία συχνά απορρίπτονται λόγω απουσίας εσωτερικής αγγείωσης. Η χρήση σύνθετων βιομιμητικών ικριωμάτων, αποτελεί μια εναλλακτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση των αυξημένων ποσοστών αποτυχίας των αυτόλογων μοσχευμάτων.Στο δεύτερο ειδικό μέρος (κεφάλαιο 5) της παρούσας διατριβής πραγματοποιείται η δημιουργία και η μελέτη σύνθετων ικριωμάτων που αποτελούνται από βιοκεραμικό σκελετό με βάση τον Ακερμανίτη (Ca2MgSi2O7), ο οποίος έχει αναβολική δράση στο σκελετικό μεταβολισμό, και επικάλυψη του συμπολυμερούς PLGA για μηχανική ενίσχυση και έλεγχο του ρυθμού βιοαποικοδόμησης. Στην επίστρωση του συμπολυμερούς ενσωματώθηκαν νανοσωματίδια διοξειδίου του πυριτίου εμπλουτισμένα με ιόντα ασβεστίου (Ca), μαγνησίου (Mg) καθώς επίσης και ιόντα χαλκού (Cu) ή/και στροντίου (Sr) που επάγουν την αγγειογένεση και οστεογένεση αντίστοιχα.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση νανοσωματιδίων πυριτίας εμπλουτισμένα με ιόντα Ca, Mg καθώς επίσης και Cu ή/και Sr με την τεχνική Sol-Gel. Στη συνέχεια διεξήχθη ο δομικός χαρακτηρισμός τους με τις τεχνικές XRD, SEM/EDS, FTIR, XRF, DLS και ο προσδιορισμός του Ζ-Δυναμικού. Επιπλέον διεξήχθη η μελέτη της βιοενεργούς συμπεριφοράς τους ώστε να διαπιστωθεί η ικανότητα τους να αναπτύσσουν απατίτη στην επιφάνεια τους. Τέλος πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση της αιμολυτικής δράση τους σε επαφή με ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια.Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες σύνθεσης του βιοκεραμικού σκελετού των σύνθετων ικριωμάτων με τη βοήθεια της τεχνικής Sol-Gel. Πραγματοποιήθηκε η σύνθεση βιοενεργών υάλων του τριμερούς συστήματος SiO2CaOMgO, οι οποίες ανήκαν στη σύσταση του ακερμανίτη. Αφού πραγματοποιήθηκε ο δομικός χαρακτηρισμός των βιοενεργών υάλων με την τεχνική της Θερμοβαρυμετρικής Ανάλυσης (TGA) - Διαφορικής Θερμικής Ανάλυσης (DTA), XRD, FTIR, ολοκληρώθηκε η μελέτη διεξάγοντας την αξιολόγηση της βιοενεργότητας. Με βάση τη μελέτη αυτή, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση βιοκεραμικών ικριωμάτων ακερμανίτη με την τεχνική αντικατάστασης σπογγώδους μήτρας (foam replica technique). Στη συνέχεια επιστρώθηκαν τα βιοκεραμικά ικριώματα με το συνθετικό συμπολυμερές PLGA στο διάλυμα του οποίου ενσωματώθηκαν τα συντεθειμένα νανοσωματίδια σε διαφορετικά ποσοστά ώστε να διερευνηθεί η επίδραση τους στη μορφολογία και στη μηχανική αντοχή. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ο δομικός χαρακτηρισμός των βιοκεραμικών και σύνθετων ικριωμάτων με τις τεχνικές XRD, FTIR, SEM/EDS, αξιολογήθηκε η βιοενεργότητα τους, οι μηχανικές τους ιδιότητες, ο ρυθμός βιοαποικοδόμησης, η ικανότητα ενθυλάκωσης και απελευθέρωσης της δραστικής ουσίας μοξιφλοξασίνης από τον βιοκεραμικό σκελετό, και η μελέτη της αιμολυτικής τους δράσης.Στο κεφάλαιο 6 παρατίθενται συνοπτικά τα συμπεράσματα που διεξήχθησαν κατά την παρούσα μελέτη και η καταγραφή των προγραμματισμένων μελλοντικών ερευνών.Με την ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής δομήθηκαν πρωτόκολλα σύνθεσης α) μεσοπορωδών νανοφορέων και ινωδών ικριωμάτων για την αντιμετώπιση των περιοδοντικών βλαβών και β) νανοσωματιδίων και καινοτόμων σύνθετων ικριωμάτων για οστική αναγέννηση, για περαιτέρω διερεύνηση της in-vivo αξιολόγησης της αναγέννησης των ιστών και σε κλινικό επίπεδο θεραπευτικών τεχνικών αντιμετώπισης της οστικής απώλειας.