Μελέτη γονιδίων των οποίων τα προϊόντα αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη SBP (Selenium Binding Protein 1) του Arabidopsis thaliana

Abstract

Selenium binding proteins (SBPs) are highly conserved and have representatives in all life kingdoms. In humans, many studies have demonstrated SBP1 importance in cancer development. In plants, SBP1 participates in biotic and abiotic stress responses. Previous studies have revealed its ability to interact with 14 proteins related to protein trafficking, membrane synthesis and redox control, indicating its participation in a novel protein network linked to oxidative stress. The aim of this thesis was to confirm the existence of the SBP1 network by studying the interacting proteins in the model plant Arabidopsis thaliana. Thus, two proteins related to protein trafficking (RD19c) and membrane synthesis (DALL3) were studied, while GRXS14, GRXS16 and SAH7 were additionally investigated for their ability to interact with SBP1. The phospholipase DALL3 and the protease RD19c were initially studied for tissue-specific expression, with the first one expressed in the root cylinder, hydothodes, guard cells, vasculature of cotyledons, first emerging leaves, sepals, siliques and anthers and in the stigma, while RD19c was expressed in guard cells, hydothodes, leaf trichomes, vasculature tissues of roots, lateral roots, first emerging leaves, cotyledons, sepals, anthers as well as in the silique base and in pollen. In these analyses it was shown that the transcipts of DALL3 and RD19c are expressed in the same tissues with those of SBP1, such as guard cells, stigma and root. Moreover, in subcellular analysis the phospholipase DALL3 was detected in the chloroplasts of the guard cells, in plastids of the root apex and the central root and in the lateral root primordia. Similarly, the protease localized in the root apex of the central and lateral roots and leaf trichomes. The relative expression levels were studied also in the allergen SAH7. The expression levels of these proteins were constitutive, with the highest expression in 10-day-old roots and flowers for DALL3 and minimum in 10-days-old seedlings and rosette leaves. The protease exhibited its highest expression levels in roots with no statistical significance difference and the lowest expression was in flowers and rosette leaves, while SAH7 was upregulated in cotyledons and shoots and downregulated in rosette leaves. Furthermore, the respective genes were studied for their induction in the presence of selenite, selenate and cadmium, and were highly expressed after selenite treatment, indicating their participation in the response mechanism related at least to this chemical compound. The initial investigation of protein-protein interactions was accomplished in yeast two-hybrid assay, which revealed the interaction of the four proteins with SBP1. In the same system, it was showed that the first 175 amino acids of SBP1 are crucial for its interaction with the DALL3 and RD19c, whereas the 105 with the GRXS14 and SAH7. Finally, the protease RD19c was detected in vesicles, the phospholipase DALL3 in speckle-like structures attached to chloroplasts and in root plastids, the gloutaredoxins GRXS14 and GRXS16 in chloroplasts, the allergen SAH7 in the endoplasmic reticulum and the SBP1 in cytoplasm and nucleus. Despite their different subcellular localization we revealed that these interactions can take place in planta. SBP1 interacts with the DALL3 in speckle-like structures attached to the chloroplasts and in root plastids, with the RD19c in cytoplasm, GRXS14 in the cytoplasm and nucleus, GRXS16 only in cytoplasm and lastly SAH7 in the endoplasmic reticulum. SBP1 is known for its participation in plant detoxification procedures against oxidative stress and our study confirms the existence of a novel protein network, where SBP1 exhibits the main role and is related to plant responses against oxidative stress.

Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν σελήνιο (SBPs) είναι πρωτεΐνες με πολύ υψηλή συντήρηση και παρούσες σε όλα τα βασίλεια της ζωής. Στον άνθρωπο, οι μελέτες είναι πολυάριθμες και η σημασία τους στη διαδικασία ανάπτυξης κακοηθειών είναι ήδη γνωστή. Στους φυτικούς οργανισμούς έχει φανεί η συμμετοχή της SBP1 στην αντιμετώπιση βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει την πιθανή ικανότητα της SBP1 να αλληλεπιδρά με δεκατέσσερις στο σύνολό τους πρωτεΐνες που σχετίζονται με την μεταφορά πρωτεϊνών μέσω κυστιδίων, την μεμβρανική σύνθεση και τον οξειδωτικό έλεγχο του κυττάρου, υποδεικνύοντας την συμμετοχή της σε ένα νέο πρωτεϊνικό δίκτυο που σχετίζεται με την οξειδωτική καταπόνηση. Σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η επιβεβαίωση της ύπαρξης του πρωτεϊνικού δικτύου της SBP1 μέσω της μελέτης των πιθανών αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών και της διερεύνησης των αλληλεπιδράσεών τους με αυτή. Έτσι, μελετήθηκαν λεπτομερώς δυο πρωτεΐνες που σχετίζονται με την μεταφορά πρωτεϊνών μέσω κυστιδίων (RD19c) και με την μεμβρανική σύνθεση (DALL3), ενώ μελετήθηκαν και άλλες τρεις πρωτεΐνες (GRXS14, GRXS16, SAH7) ως προς την ικανότητα τους να αλληλεπιδρούν με την SBP1. Η φωσφολιπάση και η πρωτεάση μελετήθηκαν ως προς την ιστοειδική τους έκφραση, όπου η πρώτη εντοπίστηκε στον αγωγό ιστό της ρίζας, στα υδατόδια, στα καταφρακτικά κύτταρα και στο αγγειακό σύστημα των κοτυληδόνων και των πρώτων φύλλων, στο αγωγό σύστημα των ανθήρων, των πετάλων και των κερατίων και στο στίγμα, ενώ η δεύτερη στα καταφρακτικά κύτταρα, στα υδατόδια των κοτυληδόνων και των πρώτων φύλλων, στις τρίχες των πρώτων φύλλων, στον αγωγό ιστό της ρίζας και των πλάγιων ριζών, των πρώτων φύλλων και των κοτυληδόνων, των πετάλων και των ανθήρων καθώς και στη βάση των κερατίων και στους γυρεόκοκκους. Με αυτό τον τρόπο δείχτηκε ότι τα μετάγραφα της DALL3 και της RD19c επάγονται στους ίδιους ιστούς με αυτούς της SBP1, όπως είναι το στίγμα, τα καταφρακτικά κύτταρα και η ρίζα. Επιπλέον, με την μελέτη του υποκυτταρικού τους εντοπισμού ανιχνεύθηκαν η φωσφολιπάση στα πλαστίδια που περιβάλλουν τον αγωγό ιστό και σε αυτά της ακραίας περιοχής της ρίζας, στις πλάγιες ρίζες και στους χλωροπλάστες των καταφρακτικών κυττάρων. Αντίστοιχα, η πρωτεάση εντοπίστηκε στην ακραία περιοχή της κεντρικής ρίζας και των πλάγιων ριζών αλλά και στις τρίχες των πρώτων φύλλων. Ως προς τα επίπεδα έκφρασης, εκτός από αυτές τις πρωτεΐνες, μελετήθηκε και το αλλεργιογόνο SAH7. Παρατηρήθηκε μια συνεχή έκφραση και για τις τρεις πρωτεΐνες με την φωσφολιπάση να έχει μέγιστο στον ιστό της ρίζας αρτιβλάστων 10 ημερών και στα άνθη και ελάχιστο στα αρτίβλαστα 10 ημερών και στα φύλλα ροζέτας. Η πρωτεάση παρουσίασε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στη ρίζα χωρίς όμως στατιστικά σημαντική διαφορά και χαμηλότερα στα άνθη και στα φύλλα ροζέτας, ενώ η SAH7 είχε μέγιστο στις κοτυληδόνες και στο βλαστό αρτιβλάστων 10 ημερών και ελάχιστο στα φύλλα ροζέτας. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν και ως προς την επαγωγή τους στην παρουσία σεληνώδους, σεληνικού και καδμίου, όπου και οι τρεις παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα παρουσία σεληνώδους, υποδεικνύοντας την συμμετοχή τους στον μηχανισμό απόκρισης τουλάχιστον αυτής της μορφής σεληνίου. Ο αρχικός έλεγχος των αλληλεπιδράσεων πραγματοποιήθηκε στο σύστημα ζύμης δύο υβριδίων, όπου αποκαλύφθηκε η αλληλεπίδραση και των τεσσάρων πρωτεϊνών που ελέγχθηκαν με την SBP1. Στο ίδιο σύστημα δείχθηκε ότι τα πρώτα 175 αμινοξικά κατάλοιπα της SBP1 είναι απαραίτητα για την αλληλεπίδρασή της με την DALL3 και την RD19c, ενώ τα πρώτα 105 για την αλληλεπίδρασή της με την γλουταρεδοξίνη 14 και το αλλεργιογόνο SAH7. Τέλος, εντοπίστηκε η πρωτεάση RD19c σε κυστίδια, η φωσφολιπάση DALL3 σε δομές που εφάπτονται στους χλωροπλάστες και στα πλαστίδια της ρίζας, τις γλουταρεδοξίνες GRXS14 και GRXS16 στους χλωροπλάστες, το αλλεργιογόνο SAH7 στο ενδοπλασματικό δίκτυο και την SBP1 στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα. Παρά τον διαφορετικό τους υποκυτταρικό εντοπισμό αποκαλύφθηκε ότι οι αλληλεπιδράσεις πραγματοποιούνται in planta. H SBP1 αλληλεπιδρά με την DALL3 σε δομές που εφάπτονται στους χλωροπλάστες, με την RD19c στο κυτταρόπλασμα, την GRXS14 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, ενώ με την GRXS16 μόνο στο κυτταρόπλασμα και τέλος με το SAH7 στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Η SBP1 έχει βρεθεί ότι συμμετέχει στις διαδικασίες αποτοξίνωσης του φυτού από την οξειδωτική καταπόνηση και από στην παρούσα διατριβή επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη του νέου πρωτεϊνικού δικτύου της SBP1, στο οποίο έχει κυρίαρχο ρόλο και σχετίζεται με την απόκριση του φυτού στην οξειδωτική καταπόνηση.