Διερεύνηση αλληλεπιδράσεων RNA-πρωτεϊνών και του ρόλου τους στη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης και της διαφοροποίησης των κυττάρων

Abstract

Accurate regulation of gene expression is controlled in many levels including mRNA’s lifecycle. mRNA stability depends mainly on their poly(A) tail length, which in turn is determined through 3'-5' exoribonucleases, known as deadenylases. Deadenylases belong to either the DEDD or the exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) superfamily, depending on their active site residues. PNLDC1 is the most recent member of the DEDD superfamily and was reported as the trimmer of pre-piRNAs, a process which takes place in the mitochondrial surface of germ cells. hPNLDC1 is located on chromosome 6 and its expression leads to the production of two different protein isoforms through alternative splicing. On the other hand, the respective gene in M. musculus is located on chromosome 17 encoding a single isoform. We have previously shown that PNLDC1 constitutes a 3'-5' exoribonuclease acting specifically on polyadenylated substrates and was found to be highly expressed in mouse embryonic stem cells E14 and testes tissues. It has also been observed that during development Pnldc1 expression levels show a gradual decrease and in differentiated cells its expression levels were detectable only after usage of demethylating agents, such as 5'-AZA-Deoxycitidine. In order to further examine the methylation pattern of Pnldc1 we performed in silico analysis of its promoter region, which in turn revealed the presence of CpG islands. Pyrosequencing analysis revealed an increased methylation of each examined position of the promoter region during differentiation of mESCs. In a next step, after silencing of PNLDC1, NGS analysis showed that PNLDC1 regulates genes with significant role in reprogramming, cell cycle and transcriptional and translational regulation. To further investigate the absence of PNLDC1 in its physiological content, we constructed stable knockout PNLDC1 mESCs cell lines employing the CRISPR/Cas9 genome editing system. Next generation sequencing was also performed in knockout mESCs and the results are in consistency with our previous data after Pnldc1 knockdown. Further verification both in cellular and molecular level, was performed using FACS and RT-qPCR analyses which showed that differential expression of PNLDC1 affects the proliferation rate and cell cycle progression in stem cells and somatic cells. More specifically, Pnldc1’s knockdown in mESCs lead to inhibition of proliferation rate causing a cell cycle arrest during the transition from the S to G2/M phase. To the contrary, ectopic expression of PNLDC1 in HEK293T leads to increased cell proliferation. This phenotype is consistent with deregulation of expression levels of important genes and non-coding RNAs related to these processes such as Malat1, Rian, Gas5 and Neat1. To validate our observation about deregulation of the protein synthesis, polysome profiling was performed. Indeed, polysomes were more abundant in WT compared to CRISPR knockout mESCs indicating a lower translational rate after PNLDC1 deficiency. Finally, using the available structure of an hPARN isoform, molecular dynamics simulation of the active site of PNLDC1 was performed followed by a high-performance virtual screening which allowed the selection of chemical compounds that could potentially act as regulatory molecules against DEDD deadenylases. The compounds were ranked according to the calculated free energy of binding and 12 were selected for further validation. Among them 5 compounds seem to be effective. More specifically, 3 of them could affect the action of both PARN and PNLDC1, one appears specifically inhibits PNLDC1 and one increases the activity of PARN. These compounds were also tested for their effect on cell viability and physiology and subsequently next generation sequencing was performed upon treatment with two compounds indicating that could affect the expression levels of genes playing role in gene expression, signal transduction and cellular response to stress. Collectively, our results suggest that PNLDC1 an important regulator of cell proliferation, transcription and translation during early differentiation and also present chemical compounds which could be used as functional modulators of PNLDC1’s activity and its downstream effects.

Η ακριβής και συντονισμένη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ελέγχεται σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένου του κύκλου ζωής των μορίων mRNA. Η σταθερότητα των μορίων mRNA εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μήκος της poly(A) ουράς τους, το οποίο με τη σειρά του ρυθμίζεται, μεταξύ άλλων από τη δράση 3’-5’ εξωριβονουκλεασών, γνωστές ως αποαδενυλάσες. Οι αποαδενυλάσες διακρίνονται σε δύο υπεροικογένειες, τις DEDD και EEP, με βάση τα κατάλοιπα στο ενεργό τους κέντρο. Η PNLDC1 αποτελεί το πιο πρόσφατο μέλος των DEDD αποαδενυλασών και έχει αναφερθεί ως η νουκλεάση που συμμετέχει στην επεξεργασία του 3’ άκρου των πρόδρομων μορίων piRNA σε γαμετικά κύτταρα. Το γονίδιο PNLDC1 στον άνθρωπο εδράζεται στο χρωμόσωμα 6 και η έκφρασή του οδηγεί στην παραγωγή δύο διαφορετικών πρωτεϊνικών ισομορφών μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Αντίθετα, το συγκεκριμένο γονίδιο στο ποντίκι εδράζεται στο χρωμόσωμα 17 και κωδικοποιεί μία μόνο ισομορφή. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι η PNLDC1 παρουσιάζει απόλυτη εξειδίκευση ως προς τα πολυαδενυλιωμένα υποστρώματα και εκφράζεται κυρίως σε γαμετικά και εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της PNLDC1 μειώνονται κατά τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη των κυττάρων και σε διαφοροποιημένα κύτταρα, η έκφρασή του παρατηρείται μόνο έπειτα από την επίδραση απομεθυλιωτικών παραγόντων όπως είναι το 5’-AZA-Deoxycitidine. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός ρύθμισης του γονιδίου της PNLDC1 στο μεταγραφικό επίπεδο πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση της περιοχής του προαγωγέα η οποία προέβλεψε την ύπαρξη CpG νησίδων, θέσεις οι οποίες είναι πιθανό να υπόκεινται σε μεθυλίωση. Ανάλυση pyrosequencing κατά τη διαφοροποίηση mESCs επιβεβαίωσε την αύξηση των επιπέδων μεθυλίωσης του προαγωγέα φανερώνοντας τις ακριβείς θέσεις καθώς και το ποσοστό μεθυλίωσης σε κάθε μία από αυτές ξεχωριστά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του γονιδίου της PNLDC1 σε mESCs και αλληλούχηση νέας γενιάς στο μεταγράφωμα αυτών έδειξαν πως η PNLDC1 συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται τον επαναπρογραμματισμό, την εξέλιξη του κυτταρικού τους κύκλου και τη ρύθμιση της μεταγραφής και της μετάφρασής τους. Έπειτα, προκειμένου να διερευνηθεί η απουσία της PNLDC1 στις φυσιολογικές συνθήκες όπου αυτή εκφράζεται, κατασκευάστηκε σταθερή κυτταρική σειρά mESCs στην οποία πραγματοποιήθηκε απαλοιφή του γονιδίου Pnldc1 χρησιμοποιώντας το σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas9. Πειράματα αλληλούχησης νέας γενιάς πραγματοποιήθηκαν εκ νέου στα κύτταρα αυτά και τα αποτελέσματα συνάδουν με αυτά έπειτα από την αποσιώπηση του συγκεκριμένου γονιδίου. Περαιτέρω μελέτη σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής και RT-qPCR ανάλυσης έδειξε πως η μείωση των επιπέδων έκφρασης της PNLDC1 στα mESCs οδηγεί στην αναστολή του ρυθμού πολλαπλασιασμού προκαλώντας τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά τη μετάβαση από τη φάση S στην G2/M. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην απορρύθμιση τόσο σημαντικών γονιδίων όσο και μη κωδικών μορίων RNA όπως τα Malat1, Rian, Gas5 και Neat1 τα οποία εμπλέκονται στις παραπάνω κυτταρικές λειτουργίες. Επιπρόσθετα, ανάλυση του πολυσωμικού προφίλ έδειξε πως στα κύτταρα αγρίου τύπου απαντάται μεγαλύτερος αριθμός πολυσωμάτων σε σύγκριση με αυτά που στερούνται την PNLDC1 γεγονός που φανερώνει το χαμηλότερο ρυθμό μετάφρασης των τελευταίων. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε έκτοπη έκφραση της PNLDC1 σε κύτταρα HEK293T η οποία οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων επαληθεύοντας τα παραπάνω αποτελέσματα. Τέλος, χρησιμοποιώντας τη διαθέσιμη δομή της hPARN πραγματοποιήθηκε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1 ακολουθούμενη από υψηλής απόδοσης εικονική αξιολόγηση η οποία επέτρεψε την επιλογή χημικών ενώσεων που εν δυνάμει μπορούν να λειτουργήσουν ως μόρια ρυθμιστές έναντι της δράσης των DEDD αποαδενυλασών. Οι ενώσεις κατατάχθηκαν με βάση την ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης και 12 από αυτές επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη εκ των οποίων 5 εμφάνισαν in vitro δραστικότητα. Συγκεκριμένα, 3 από αυτές αναστέλλουν τη δράση και των δύο αποαδενυλασών, μία φαίνεται να αναστέλλει αποκλειστικά την PNLDC1, ενώ μία δρα ως ενεργοποιητής της PARN. Οι ενώσεις αυτές εξετάστηκαν περαιτέρω ως προς την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα και τη φυσιολογία των κυττάρων και επακόλουθη αλληλούχηση νέας γενιάς έδειξε πως δύο από αυτές επηρεάζουν γονίδια τα οποία εμπλέκονται σε βασικές βιολογικές λειτουργίες όπως είναι η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, η μεταγωγή σήματος και η απόκριση στο στρες. Συλλογικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν τη PNLDC1 ως σημαντικό ρυθμιστή της μεταγραφής, της μετάφρασης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά πρώιμα στάδια διαφοροποίησης ενώ παράλληλα αποκαλύπτουν την ύπαρξη χημικών ενώσεων οι οποίες μπορούν να αξιοποιηθούν ως ενεργοί ρυθμιστές της δράσης του ενζύμου αυτού.