Μηχανισμοί αναγέννησης του μυοκαρδίου: μελέτη του ρόλου της δεσμίνης στα χαρακτηριστικά και τη διαφοροποίηση των ενήλικων καρδιακών προγονικών CSP και Sca1+ κυττάρων

Abstract

Cardiomyopathies are the major cause of death worldwide, leading to heart failure in most cases. Unfortunately, the implementation of a treatment is not always possible, especially in cases of heart failure where a heart transplant is required. The discovery that the adult heart has a low turnover capacity, as well as finding progenitor cells in the adult myocardium, was a great achievement for the development of pioneering therapies for the treatment of heart diseases.Numerous studies have been conducted in this direction in the last two decades, where the basic properties and differentiating capacity of adult cardiac progenitor cells have been studied. Although experimental results are often quite optimistic about their regenerative capacity, the success rate is very low, which makes it difficult to use them clinically. In fact, this observation has triggered a long scientific debate over the endogenous differentiating ability of cardiac progenitor cells into myocardial cells. The aim of this PhD thesis was to isolate and characterize the adult progenitor cells of the heart that express the phenotype of "Cardiac Side Population" (CSP), as well as the cells that express the stem cell surface marker Sca1 (Sca1+) from the mouse model with desmin deficiency.Desmin, the major muscle specific protein of Intermediate Filaments (IF) and the earliest myogenic marker, has been shown to play an important role during the differentiation of embryonic stem cells (ESCs), while it is expressed in the CSP cells of adult mouse. Taking into account the importance of desmin in ensuring the proper development and function of myocardial cells (in its absence are observed mitochondrial damage, severe cell death and development of Dilated Cardiomyopathy) both during development and in the adult stages, it is hypothesised that it may also be involved in the appearance of the characteristics of CSP and Sca1+ progenitor cells with a direct impact on their regenerative capacity.In order to answer the above questions, cardiac CSP and Sca1+ cells were isolated from desmin deficient (des-/-) and wild type (wt) adult mice and were transcriptionally characterized in terms of the expression of cardiac gene markers. At the same time, as CSP cells constitute a heterogeneous population, they were also phenotypically characterized in terms of the expression of cell surface markers in order to determine the role of desmin in the various CSP subpopulations. From the experiments performed, it was found that unlike Sca1+ cells, the absence of desmin affected the percentage of total CSP cells, which was significantly increased in des-/- mice compared to wt, as well as the various subpopulations of CSP cells. This increase was found to be unrelated to a direct effect of desmin on CSP cell proliferation, as differences in the expression of cell cycle gene markers observed immediately after CSP cell isolation, a situation that reflects the in vivo condition, were eliminated upon culture, while at the same time the proliferation rate of CSP cells in vitro did not differ between the two genotypes. In contrast, desmin appears to play an indirect role in the proliferation of CSP cells through the microenvironment and the conditions prevailing in des-/- myocardium, such as fibrosis, inflammation and cardiomyocyte death, as in 15 days old des-/- mice, which have not developed yet the pathological phenotype, and also in des-/- mice in which the phenotype was rescued after overexpression of the small heat-shock protein αB-crystallin, the percentage of CSP cells did not differ compared to the corresponding wt mice.During the transcriptional characterization, CSP and Sca1+ cells were observed to express gene markers of cardiac progenitor cells, but not of differentiated cardiomyocytes. In addition, it was found that the lack of desmin is involved in the proper expression of cardiac transcription markers Mef2c and Nkx2.5, the levels of which were significantly reduced immediately after isolation or after culture, respectively, compared to wt, which advocates for the role of desmin in the cardiac commitment of CSP and Sca1+ cells.In order to furtherly investigate the role of desmin in the differentiation of CSP and Sca1+ towards cardiomyocytes, their differentiation was induced using the methyltransferase inhibitor 5-azacitidine. It was observed that des-/- CSP cells in relation to wt showed a reduced expression of the Nkx2.5 gene, while des-/- Sca1+ cells showed a reduced expression of the Myh6 gene, facts which on the one hand indicate that desmin is differentially involved in the differentiation of the two cell types and, on the other hand, its role relies mainly on their early commitment to cardiomyocytes. However, with this methodology, no satisfactory cardiomyogenic differentiation of the cells was observed, as no expression of any of the markers of mature cardiomyocytes was detected in protein level. In order to overcome the above obstacle and to fully clarify the role of desmin in cardiomyocyte differentiation, an alternative experimental approach was followed in which induction of Sca1+ cell differentiation was performed after overexpression of the cardiac transcription factors Gata4, Mef2c and Tbx5 (GMT), which can induce the reprogramming of cardiac fibroblasts directly into cardiomyocytes. The results showed that desmin affected the expression of Myh6 gene only at mRNA level which was significantly reduced in des-/- Sca1+ cells compared to wt, while at protein level no differences were observed in the expression of proteins of the mature cardiomyocytes between the two genotypes.As can be seen from the above, the role of desmin in the characteristics of the cardiac progenitor cells seems to be limited in vivo, mainly through the events that follow its absence. As many studies suggest that conditions similar to those prevalent in des-/- myocardium are involved in the aging of stem cells, it was studied whether the absence of desmin affects the aging of CSP and Sca1+ cells, which would have a negative impact on their ability to differentiate and, consequently, to their further use in clinical trials to repair myocardial damage. The results indicted that desmin’s absence leads to the overexpression of the aging marker p16INK4α only in Sca1+ cells, however without the correlation of the telomere length and the induction of Sca1+ aging in vitro.It is concluded that the role of desmin in the CSP and Sca1+ progenitor populations of the adult mouse heart, is mainly limited to their early cardiomyocyte commitment rather to their eventual differentiation, which is laso confirmed by differentiation studies in ESCs. The above finding is important for the development of new improved methodologies in order to more effectively and targeted differentiate progenitor cells into cardiomyocytes, as their limited differentiation towards cardiomyocytes is the major problem in their use in clinical trials which has provoked much controversy in the scientific community.

Οι μυοκαρδιοπάθειες αποτελούν την κυριότερη αιτία θανάτου παγκοσμίως, οδηγώντας στην πλειονότητα των περιπτώσεων σε καρδιακή ανεπάρκεια. Δυστυχώς, η εφαρμογή κάποιας θεραπευτικής μεθόδου δεν είναι πάντοτε εφικτή, ειδικά στις περιπτώσεις καρδιακής ανεπάρκειας, όπου απαιτείται η μεταμόσχευση καρδιάς. Η ανακάλυψη προγονικών κυττάρων στο ενήλικο μυοκάρδιο, καθώς και ότι η ενήλικη καρδιά διαθέτει μια μικρή αναγεννητική ικανότητα, αποτέλεσε ένα σπουδαίο επίτευγμα για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων με σκοπό την αντιμετώπιση και τη θεραπεία των καρδιακών παθήσεων. Προς αυτή την κατεύθυνση, έχει πραγματοποιηθεί πληθώρα ερευνών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, όπου μελετήθηκαν τα χαρακτηριστικά και η διαφοροποιητική ικανότητα των ενήλικων καρδιακών προγονικών κυττάρων. Παρόλο που τα πειραματικά αποτελέσματα τις πλείστες φορές είναι αρκετά αισιόδοξα ως προς την αναγεννητική τους ικανότητα, το ποσοστό επιτυχίας είναι πολύ μικρό, γεγονός το οποίο δυσχεραίνει τη χρήση τους σε κλινικό επίπεδο. Η συγκεκριμένη παρατήρηση, μάλιστα, έχει ξεκινήσει ένα μακροσκελή επιστημονικό διάλογο ως προς την ενδογενή ικανότητα διαφοροποίησης των καρδιακών προγονικών κυττάρων προς μυοκαρδιοκύτταρα, ο οποίος στηρίζεται στον ακριβέστερο χαρακτηρισμό τους. Στόχος της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός των ενήλικων προγονικών κυττάρων της καρδιάς που εκφράζουν τον φαινότυπο του «Παράπλευρου Πληθυσμού» (Cardiac Side Population, CSP), καθώς και των κυττάρων που εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον δείκτη Sca1 (Sca1+) από το μοντέλο ποντικού με έλλειψη δεσμίνης.Η δεσμίνη, η οποία αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των Ενδιάμεσων Ινιδίων (Intermediate Filaments, IF) των μυϊκών κυττάρων και τον πιο πρώιμο μυϊκό δείκτη, έχει δειχθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων προς μυϊκά κύτταρα, ενώ εκφράζεται και στον προγονικό πληθυσμό των CSP κυττάρων της καρδιάς ενήλικων ποντικών. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τη σπουδαιότητα της δεσμίνης στη διασφάλιση της σωστής ανάπτυξης και λειτουργιάς των μυοκαρδιοκυττάρων (απουσία της παρατηρούνται βλάβες των μιτοχονδρίων, έντονος κυτταρικός θάνατος και ανάπτυξη Διατατικής Μυοκαρδιοπάθειας), τόσο κατά την ανάπτυξη, όσο και κατά τα ενήλικα στάδια, προκύπτει η υπόθεση ότι ενδεχομένως να εμπλέκεται και στην εμφάνιση των χαρακτηριστικών των CSP και Sca1+ προγονικών κυττάρων με άμεσο αντίκτυπο στην αναγεννητική τους ικανότητα.Με σκοπό να απαντηθούν τα παραπάνω ερωτήματα, ενήλικα CSP και Sca1+ κύτταρα απομονώθηκαν από καρδιές ποντικών με έλλειψη δεσμίνης (des-/-) και αγρίου τύπου (wt) και αρχικά, χαρακτηρίστηκαν γονιδιακά ως προς την έκφραση γονιδίων δεικτών των καρδιακών κυττάρων για τον προσδιορισμό του χαρακτήρα τους και του αναπτυξιακού σταδίου-βαθμού διαφοροποίησης στο οποίο βρίσκονται. Παράλληλα, καθώς τα CSP κύτταρα συνιστούν έναν ετερογενή πληθυσμό, χαρακτηρίστηκαν και φαινοτυπικά ως προς την έκφραση δεικτών της κυτταρικής επιφάνειας με σκοπό τον προσδιορισμό του ρόλου της δεσμίνης στους διάφορους CSP υποπληθυσμούς. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκε ότι σε αντίθεση με τα Sca1+ κύτταρα, το ποσοστό των οποίων δεν σημείωσε διαφορές μεταξύ των δύο γενοτύπων, η απουσία της δεσμίνης επηρεάζει τόσο το ποσοστό των ολικών CSP κυττάρων, ο οποίος ήταν σημαντικά αυξημένος στα des-/- ποντίκια σε σχέση με τα wt, όσο και διάφορους υποπληθυσμούς των CSP κυττάρων. Η παρατηρούμενη αυτή αύξηση, βρέθηκε να μην σχετίζεται με την επίδραση της δεσμίνης άμεσα στον πολλαπλασιασμού των CSP κυττάρων, καθώς οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων δεικτών του κυτταρικού κύκλου που παρατηρούνται αμέσως μετά την απομόνωση των CSP κυττάρων, συνθήκη που αντικατοπτρίζει την in vivo κατάσταση, εξαλείφονται κατά την παραμονή των κυττάρων στην καλλιέργεια, ενώ ταυτόχρονα, και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων in vitro δεν σημείωσε διαφορές μεταξύ των δύο γενοτύπων. Αντίθετα, η δεσμίνη φαίνεται να διαδραματίζει έναν έμμεσο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των CSP κυττάρων μέσω του μικροπεριβάλλοντος και των συνθηκών που επικρατούν στο des-/- μυοκάρδιο, όπως είναι η ίνωση, η φλεγμονή και ο θάνατος των μυοκαρδιοκυττάρων, καθώς στα des-/- ποντίκια ηλικίας 15 ημερών στα οποία δεν έχει εμφανισθεί ακόμα ο παθολογικός φαινότυπος, αλλά και στο μοντέλο ποντικού με έλλειψη δεσμίνης στο οποίο έχει γίνει αναστροφή του des-/- φαινοτύπου μετά από υπερέκφραση της πρωτεΐνης αΒ-κρυσταλλίνης, το ποσοστό των CSP κυττάρων δεν παρατηρείται αυξημένο σε σχέση με τα αντίστοιχα wt ποντίκια. Κατά το γονιδιακό χαρακτηρισμό των CSP και Sca1+ κυττάρων, παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα αυτά εκφράζουν δείκτες των καρδιακών προγονικών κυττάρων, αλλά όχι των διαφοροποιημένων μυοκαρδιοκυττάρων. Επίσης, βρέθηκε ότι η έλλειψη δεσμίνης εμπλέκεται στην έκφραση των καρδιακών μεταγραφικών παραγόντων Mef2c και Nkx2.5, τα επίπεδα των οποίων ήταν σημαντικά μειωμένα αμέσως μετά την απομόνωσή τους ή μετά από παραμονή σε καλλιέργεια, αντίστοιχα, συγκριτικά με τα wt, γεγονός το οποίο συνηγορεί υπέρ του ρόλου της δεσμίνης στον καρδιακό καθορισμό των CSP και Sca1+ κυττάρων.Με σκοπό να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος της δεσμίνης στη διαφοροποίηση των CSP και Sca1+ προς μυοκαρδιοκύτταρα, πραγματοποιήθηκε επαγωγή της διαφοροποίησης με τη χρήση του αναστολέα των μεθυλοτρανσφερασών, 5-αζακυτιδίνη. Παρατηρήθηκε ότι τα des-/- CSP κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του γονιδίου Nkx2.5 σε σχέση με τα wt, ενώ τα des-/- Sca1+ κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του γονιδίου Myh6, γεγονότα τα οποία, αφενός, υποδεικνύουν ότι η δεσμίνη εμπλέκεται με διαφορετικό τρόπο στη διαφοροποίηση των δύο κυτταρικών τύπων και, αφετέρου, ότι ο ρόλος της έγκειται κυρίως στον πρώιμο καθορισμό των κυττάρων προς μυοκαρδιοκύτταρα. Ωστόσο, με τη συγκεκριμένη μεθοδολογία δεν παρατηρήθηκε ικανοποιητική διαφοροποίηση των κυττάρων προς μυοκαρδιοκύτταρα, καθώς σε πρωτεϊνικό επίπεδο δεν ανιχνεύθηκε έκφραση κανενός από τους δείκτες των ώριμων μυοκαρδιοκυττάρων. Προκειμένου να παρακαμφθεί το παραπάνω εμπόδιο και να γίνει πλήρης αποσαφήνιση του ρόλου της δεσμίνης στη διαφοροποίηση, ακολουθήθηκε μια εναλλακτική πειραματική προσέγγιση, κατά την οποία πραγματοποιήθηκε επαγωγή της διαφοροποίησης των Sca1+ κυττάρων μετά από υπερέκφραση των καρδιακών μεταγραφικών παραγόντων Gata4, Mef2c και Tbx5 (GMT), οι οποίοι μπορούν να επάγουν τον επαναπρογραμματισμό των καρδιακών ινοβλαστών απευθείας σε μυοκαρδιοκύτταρα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι η δεσμίνη επηρεάζει σε επίπεδο mRNA μόνο την έκφραση του γονιδίου Myh6 κατά την διαφοροποίηση των Sca1+ κυττάρων, η οποία ήταν σημαντικά μειωμένη στα des-/- κύτταρα συγκριτικά με τα wt, ενώ σε πρωτεϊνικό επίπεδο, ομοίως με παραπάνω, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση πρωτεϊνών των ώριμων μυοκαρδιοκυττάρων. Όπως προκύπτει από τα παραπάνω, ο ρόλος της δεσμίνης στα χαρακτηριστικά των προγονικών κυττάρων φαίνεται να περιορίζεται in vivo, κυρίως μέσω των γεγονότων που ακολουθούν την απουσία της. Καθώς πλήθος μελετών υποδεικνύουν ότι συνθήκες παρόμοιες με αυτές που επικρατούν στο des-/- μυοκάρδιο εμπλέκονται στη γήρανση των προγονικών κυττάρων, μελετήθηκε εάν η απουσία της δεσμίνης επηρεάζει τη γήρανση των CSP και Sca1+ κυττάρων, γεγονός το οποίο θα είχε αρνητικό αντίκτυπο στην ικανότητα διαφοροποίησής τους και, κατ’ επέκταση, στην περαιτέρω χρήση τους σε κλινικές μελέτες με σκοπό την αποκατάσταση βλαβών του μυοκαρδίου. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τον έλεγχο έκφρασης δεικτών γήρανσης, της μέτρησης του μήκους των τελομερών, καθώς και του προσδιορισμού των γερασμένων κυττάρων με τη χρήση του αντιδραστηρίου Sentragor, υπέδειξαν ότι η απουσίας της δεσμίνης επηρεάζει την έκφραση του δείκτη p16INK4α από τα Sca1+ κύτταρα, χωρίς όμως τη συσχέτιση του μήκους των τελομερών ή την επαγωγή της γήρανσης των Sca1+ κυττάρων. Συμπεραίνεται ότι ο ρόλος της δεσμίνης στους CSP και Sca1+ προγονικούς πληθυσμούς της καρδιάς των ενήλικων ποντικών, περιορίζεται κυρίως στον πρώιμο καθορισμό τους προς μυοκαρδιοκύτταρα και όχι τόσο στην τελική διαφοροποίησή τους, γεγονός το οποίο επιβεβαιώνεται και από μελέτες διαφοροποίησης στα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα. Το παραπάνω εύρημα είναι σπουδαίας σημασίας για την ανάπτυξη νέων βελτιωμένων μεθοδολογιών με σκοπό την αποτελεσματικότερη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων στοχευμένα προς μυοκαρδιοκύτταρα, αντί άλλων τύπων καρδιακών κυττάρων, καθώς η περιορισμένη διαφοροποίησή τους προς μυοκαρδιοκύτταρα αποτελεί το μείζον πρόβλημα κατά τη χρήση τους σε κλινικές μελέτες, το οποίο έχει πυροδοτήσει, μάλιστα, μεγάλο διάλογο αμφισβήτησης στην επιστημονική κοινότητα.