Οι επιδράσεις της μητρικής αποστέρησης κατά την πρώιμη ηλικία στον προγραμματισμό του άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-επινεφρίδια στην ενήλικη ζωή: ατομικές γενετικές διαφορές και φαινότυποι

Abstract

The experiences of a person during the early developmental stages play a decisive role both, in brain development and subsequent behavior in adulthood. Disruption of the mother-child relationship in the early childhood period is a strong risk factor for chronic stress, which significantly affects the behavior and adaptation ability in later life. The neurodevelopmental consequences of early life stress have been studied by many researchers, who have documented the importance of maternal behavior in mammals. However, the mechanisms underlying these relationships have not yet been fully elucidated. One of the most indisputable breakthroughs for solving this riddle is the finding that the deregulation of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis plays an instrumental role in the long-term effects of early stress. To investigate these mechanisms several experimental models resembling the stress of maternal separation have been developed, which vary widely in duration and intensity. The disparate conclusions drawn from these studies underscore the complexity of the stress response and the importance of individuality.To study in more detail the above interactions, a robust model of early life stress was used that combines maternal separation and premature weaning, which was applied to Balb/c and CD1 mouse strains. This protocol included a daily separation of the pups from their mothers for a few hours followed by early weaning on day 17 (maternal separation with early weaning, MSEW group). The remaining littermates were left with their mother and were weaned on day 25 (control group). After the animals reached adulthood, a series of behavioral tests were performed (Elevated Plus Maze, EPM, Open Field Test, OFT, and Forced Swimming Test, FST) to evaluate anxiety- and depression-like behaviors. We observed that the MSEW mice, especially in the Balb/c strain, were generally more "anxious" and "depressed" than those who grew up with their mother's care, with some of them exhibiting higher levels of anxiogenic-like behavior (their performance in the tests deviated significantly from the average). Representative animals from each group, and from both strains, were then selected to further investigate the individual differences identified. The sensitivity of the HPA axis was assessed by determining blood serum corticosterone levels before and after exposure to an acute stressor. Control mice did not show significant changes in the concentrations of the hormone, in contrast to the mice of the MSEW group which displayed large fluctuations, with some individuals showing a very high concentration (high stress response group), and others showing a concentration similar to the control group (low stress response group). The fact that not all animals in the MSEW group responded in the same way underscores the importance of understanding the underlying mechanisms responsible for the individual differences in stress responses.After completing the biochemical analysis, the animals were euthanized, and several brain areas were isolated to investigate the effects of early maternal stress on the expression of genes involved in HPA axis regulation and brain function. The findings showed significant changes in the expression of glucocorticoid receptors in the hippocampus, both at the mRNA and protein levels. There was a substantial increase in MR (but not GR) mRNA RNA levels in the MSEW group, indicating a change in the GR-MR balance, and a possible deregulation of the action mediated by these two transcription factors in the limbic system of the brain, which could lead to inadequate stress response. These changes were accompanied by an increase in the mRNA levels of GILZ, a direct target of glucocorticoid receptors and a reliable marker of their activity, which has been associated with HPA axis dysfunction and psychosocial stress. We also observed an induced activation of GR in the MSEW group. Interestingly, the increase in cells where the receptor is active (phospho-GRSer211+) also included the granular layer of the dentate gyrus, suggesting a potential dysregulation of neurogenesis in the maternally deprived animals. This observation is consistent with studies showing that glucocorticoids can regulate the generation of new neurons in hippocampus through the GR receptors which are present there. Importantly, we also noticed a preferential effect of maternal deprivation on the expression of GR in the pyramidal layers of the hippocampus, since contrary to CA1, its levels were significantly reduced in CA3, an area especially vulnerable to stress.We also examined whether the experimental protocol we applied had affected the expression of genes involved in neuronal plasticity and neurogenesis. We observed a significant increase in the mRNA levels of DRD1, a gene that encodes the most abundant dopamine receptor in the brain, as well as a substantial decrease in the mRNA levels of the proneural bHLH transcription factor NGN2, which is very important for the control of neural stem cell fate and neurogenesis in the hippocampus. Although these changes were not evaluated at the protein level, they suggest that the maternal stress may deregulate the generation of new neurons in the adult brain, a process that is considered particularly vulnerable to environmental factors in the early stages of life. Moreover, they support recent studies showing that new neurons could play an important role in in the recovery of the HPA axis after stress. A deeper understanding of the mechanisms by which early maternal stress can disrupt not only the function of the HPA axis, but also its interaction with the continuous process of neurogenesis in the hippocampus, is expected to expand our knowledge about the changes triggered by this form of stress, in behavior and adaptation in adult life. In addition, the findings of this dissertation, and the further exploitation of the maternal deprivation model used here, could contribute in future investigations of the mechanisms affecting individual susceptibility to stress, as well as in efforts aiming to develop better strategies for preventing and treating disorders resulting from the exposure to early maternal stress.

Oι εμπειρίες που βιώνει ένα άτομο στα πρώιμα αναπτυξιακά του στάδια, διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο τόσο στην ανάπτυξη του εγκεφάλου του, όσο και στην συμπεριφορά του στην ενήλικη περίοδο της ζωής. Η διατάραξη της σχέσης μητέρας - παιδιού στην πρώιμη παιδική ηλικία αποτελεί έναν ισχυρό παράγοντα χρόνιου στρες ο οποίος επιδρά σημαντικά στην διαμόρφωση της συμπεριφοράς και της ικανότητας προσαρμογής του ενήλικου ατόμου. Οι νευροαναπτυξιακές επιπτώσεις του πρώιμου στρες έχουν μελετηθεί από πολλούς ερευνητές, και έχει επιβεβαιωθεί η σπουδαιότητα της μητρικής συμπεριφοράς σε όλα τα θηλαστικά. Εντούτοις, οι μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις σχέσεις δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Ένα από τα αδιαμφισβήτητα στοιχεία για την επίλυση αυτού του γρίφου, αποτελεί η διαπίστωση ότι η απορρύθμιση της λειτουργίας του άξονα Υποθάλαμος-Υπόφυση-Επινεφρίδια (ΥΥΕ), διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις του στρες της πρώιμης ηλικίας. Για τη διερεύνηση αυτών των μηχανισμών έχει δημιουργηθεί μια πληθώρα πειραματικών μοντέλων που προσομοιάζουν το στρες του μητρικού αποχωρισμού, τα οποία παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία τόσο στην διάρκεια όσο και στην ένταση τους. Τα διαφορετικά συμπεράσματα που προκύπτουν από αυτές τις μελέτες τονίζουν την πολυπλοκότητα του συστήματος του στρες αλλά και τη σημασία της ατομικότητας στην απόκριση στα στρεσογόνα ερεθίσματα. Προκειμένου να μελετηθούν αναλυτικότερα οι παραπάνω αλληλεπιδράσεις, χρησιμοποιήθηκε ένα από τα πιο ισχυρά πρωτόκολλα μητρικού αποχωρισμού και πρόωρου απογαλακτισμού, το οποίο εφαρμόστηκε σε νεογνούς μύες των φυλών Balb/c και CD1. Το πρωτόκολλο αυτό περιελάμβανε μητρική αποστέρηση των νεογνών από τις μητέρες τους για κάποιες ώρες καθημερινά, και συνδυαζόταν με τον πρώιμο απογαλακτισμό τους τη μεταγεννητική ημέρα 17 (ομάδα MSEW). Τα υπόλοιπα νεογνά μεγάλωναν με τη συνεχή παρουσία της μητέρας τους και απογαλακτίζονταν την μεταγεννητική ημέρα 25 (ομάδα ελέγχου). Μετά την ενηλικίωση των πειραματόζωων πραγματοποιήθηκαν συμπεριφορικές δοκιμασίες προκειμένου να αξιολογηθεί η αγχώδης (δοκιμασίες ανυψωμένου λαβυρίνθου [EPM] και ανοιχτού πεδίου [OFT]) και η καταθλιπτική συμπεριφορά (δοκιμασία εξαναγκασμένης κολύμβησης [FST]). Διαπιστώσαμε ότι οι μύες στους οποίους εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο MSEW, ιδιαίτερα της φυλής Balb/c εμφανίστηκαν πιο «αγχωμένοι» και «καταθλιπτικοί» σε σχέση με αυτούς που μεγάλωσαν φυσιολογικά με τη διαρκή φροντίδα της μητέρας τους, ενώ κάποια μεμονωμένα πειραματόζωα επέδειξαν ιδιαίτερα διαταραγμένες συμπεριφορές (οι επιδόσεις τους απέκλιναν σημαντικά από τον μέσο όρο). Στη συνέχεια, με βάση αυτές τις διαφορές επιλέχθηκαν αντιπροσωπευτικά πειραματόζωα και από τις δύο φυλές προκειμένου να διερευνηθούν περισσότερο οι ατομικές αποκλίσεις που εντοπίστηκαν. Η ευαισθησία του άξονα ΥΥΕ, εκτιμήθηκε με τον προσδιορισμό των επιπέδων της κορτικοστερόνης στον ορό του αίματος πριν και μετά από την έκθεσή τους σε έναν οξύ στρεσογόνο παράγοντα. Οι μύες της ομάδας ελέγχου παρουσίασαν παρόμοιες συγκεντρώσεις της ορμόνης σε αντίθεση με τους μύες της ομάδας MSEW που εμφάνισαν διακυμάνσεις, με κάποιους να παρουσιάζουν πολύ αυξημένη συγκέντρωση (ομάδα υψηλής απόκρισης στο στρες), και άλλους με συγκέντρωση παρόμοια με εκείνη της ομάδας ελέγχου (ομάδα χαμηλής απόκρισης στο στρες). Το γεγονός ότι δεν ανταποκρίνονται όλα τα ζώα της ομάδας MSEW με τον ίδιο τρόπο υπογραμμίζει τη σημασία που έχει η κατανόηση των βαθύτερων μηχανισμών που ευθύνονται για τις ατομικές διαφορές στο χρόνιο στρες. Μετά την ολοκλήρωση των βιοχημικών μετρήσεων, απομονώθηκαν διάφορες περιοχές του εγκεφάλου ώστε να διερευνηθεί η επίδραση του πρώιμου μητρικού στρες στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του άξονα HPA και τη λειτουργία του εγκεφάλου. Τα ευρήματα έδειξαν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των υποδοχέων των γλυκοκορτικοειδών στον ιππόκαμπο, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και πρωτεΐνης. Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του mRNA για τον MR (αλλά όχι για τον GR) στην ομάδα MSEW, υποδεικνύοντας μια μεταβολή στην ισορροπία του συστήματος GR/MR, και μια πιθανή απορρύθμιση του συντονισμού των δράσεων που διαμεσολαβούνται από αυτούς τους δύο μεταγραφικούς παράγοντες στο μεταιχμιακό σύστημα του εγκεφάλου, που θα μπορούσε να οδηγήσει σε ανεπαρκή απόκριση στο στρες. Οι αλλαγές αυτές συνοδεύτηκαν από αύξηση των επιπέδων mRNA του γονιδίου GILZ, ενός σημαντικού μεταγραφικού στόχου των υποδοχέων των γλυκοκορτικοειδών, και αξιόπιστο δείκτη της ενεργότητάς τους, το οποίο έχει συνδεθεί με τη δυσλειτουργία του άξονα YYE και το ψυχοκοινωνικό στρες. Παρατηρήσαμε επίσης αυξημένη ενεργοποίηση του GR στην ομάδα MSEW, ενώ ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρον το εύρημα ότι η αύξηση των κυττάρων στα οποία ο υποδοχέας είναι ενεργός (phospho-GRSer211 +) συμπεριελάμβανε και την κοκκιώδη στιβάδα της οδοντωτής έλικας, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή διαταραχή της νευρογένεσης στα ζώα που είχαν υποστεί το μητρικό στρες. Η παρατήρηση αυτή συνάδει με μελέτες που δείχνουν ότι τα γλυκοκορτικοειδή μπορούν να ρυθμίζουν τη γέννηση νέων νευρικών κυττάρων μέσω των υποδοχέων GR που βρίσκονται στον ιππόκαμπο. Διαπιστώσαμε μάλιστα μια επιλεκτικότητα στην επίδραση της μητρικής αποστέρησης στην έκφραση του GR στις πυραμιδικές στοιβάδες του ιππόκαμπου, αφού σε αντίθεση με την CA1, τα επίπεδά του ήταν σημαντικά μειωμένα στην CA3, μια περιοχή εξαιρετικά ευάλωτη στο στρες. Διερευνώντας κατά πόσον το πειραματικό πρωτόκολλο που εφαρμόσαμε είχε επηρεάσει την έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στη διαμόρφωση της πλαστικότητας του εγκεφάλου και τη νευρογένεση, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση των επιπέδων mRNA του γονιδίου DRD1, και μια αντίστοιχη μείωση των επιπέδων mRNA του μεταγραφικού παράγοντα NGN2 ο οποίος είναι πολύ σημαντικός για τον καθορισμό του πεπρωμένου των νευρικών βλαστικών κυττάρων και τη νευρογένεση στον ιππόκαμπο. Αν και δεν ελέχθηκαν αυτές οι αλλαγές σε πρωτεϊνικό επίπεδο, οι συγκεκριμένες μεταβολές δείχνουν ότι το μητρικό στρες μπορεί να απορρυθμίσει τη γέννηση νέων νευρώνων στον ενήλικο εγκέφαλο, μια διαδικασία η οποία θεωρείται ιδιαίτερα ευαίσθητη στους περιβαλλοντικούς παράγοντες στα πρώτα στάδια της ζωής, και ενισχύουν πρόσφατες μελέτες που παρουσιάζουν ενδείξεις ότι οι νέοι νευρώνες μπορεί να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αποκατάσταση του άξονα YYE μετά το στρες. Η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών μέσω των οποίων το πρώιμο μητρικό στρες μπορεί να διαταράσσει όχι μόνο τη λειτουργία του άξονα YYE, αλλά και την αμοιβαία αλληλεπίδρασή του με τη συνεχή διαδικασία της νευρογένεσης στην περιοχή του ιππόκαμπου, αναμένεται να διευρύνει τις γνώσεις μας σχετικά με τις αλλαγές που προκαλεί αυτή η μορφή στρες στην συμπεριφορά και στην προσαρμοστική ικανότητα στην ενήλικη ζωή. Επιπλέον, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής, και η περαιτέρω αξιοποίηση του μοντέλου μητρικής αποστέρησης που χρησιμοποιήθηκε, θα μπορούσαν να συμβάλλουν μελλοντικά στη διερεύνηση των μηχανισμών που επηρεάζουν την ατομική ευαισθησία στο στρες, καθώς και στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών πρόληψης και αντιμετώπισης διαταραχών που προκύπτουν από το πρώιμο μητρικό στρες.