Γονιδιωματική και μεταβολομική ανάλυση θαλάσσιων μικροφυκών

Abstract

Over the past few decades, microalgae have attracted the scientific interest due to their numerous advantages and applications. They are primary producers of oxygen for plenty of organisms and occupy the base in food chain. Optimization of parameters which regulate cell function is a critical step in microalgal exploitation. Many new and advanced biotechnological technologies have been adopted as tools for the determination of microalgal origin, physiology, cell function and metabolism. In this context two very promising approaches, whole genome sequencing method and integrated omic analysis, were performed in order to enrich the existing knowledge on marine phytoplankton. Metabolic profiling on microalgal strains with scientific or/and commercial interest could provide a better understanding of their cell mechanisms, the first step in metabolic engineering. The lack of sequenced microalgal genomes consist a major obstacle for the study of gene regulation and metabolic response. For this reason, Next Generation Sequencing method Illumina 2000 HiSeq was carried out for the determination of nuclear, plastid and mitochondrial genome of microalga Chlorella minutissima UTEX 2341. De novo assembly of the nucleotide sequence was performed using the assemblers Velvet and Geneious. Chloroplastic gene prediction was executed ab initio with Glimmer 3 software. Annotation was performed by using RAST (Rapid Annotation Subsystem Technology) algorithm and the already sequenced genome of Auxenochlorella protothecoides as a reference genome. Surprisingly, NGS sequencing and phylogenetic analysis revealed that strain UTEX 2341 is actually erroneously characterized as Chlorella since it bears a striking similarity to A. protothecoides. The assembly resulted in the 32.7 Mb final draft genome corresponding to 200x genome coverage. Additionally, the microalgal gene characteristics were determined and gene mapping was performed based on the existing sequenced genomes.Environmental conditions affect intensely both their metabolic and transcriptomic profiles, resulting in production of numerous compounds with applications in pharmaceuticals, cosmetics, nutrition and biofuel. The properties of light are fundamental parameters affecting all photosynthetic organisms. In an attempt to detect global changes occurring during environmental light alteration, an integrated omic approach was employed while the results were evaluated using different statistical approaches. In this context, the metabolic model of A. protothecoides UTEX 2341 (formerly known as C. minutissima) was studied under different light intensities but also under red and blue monochromatic irradiance to determine its metabolic response to the provided quantity and quality of the illumination. According to the present study, the metabolism of A. protothecoides is significantly affected by red monochromatic radiation and prolonged darkness, increasing the levels of many metabolites. Then, a comparative metabolomic analysis of economically important microalgae species Nannochloropsis gaditana, Tetraselmis chuii and Phaeodactylum tricornutum, grown under red, blue and green filtered light source, was performed by GC-MS based technology. Lipid content was also determined by GC-FID analysis, while a real-time qPCR based platform was developed for the profiling of N. gaditana genes involved in primary and secondary metabolism. Photosynthetic limitation caused decreased cell density in all treatments and strains compared to control light. Integrated transcriptomic and metabolomic results revealed extensive metabolic adaptations of N. gaditana triggered by light quality. Each strain responded differently by changing its chemical composition for the purpose of adapting to the new environment. The combined transcriptomic and metabolomic results revealed extensive metabolic adaptations triggered by light quality. In summary, an overall induction in both transcripts and metabolites, involved mainly in amino acid metabolism, was observed under red filtered illumination. Narrow blue light provoked decreased carbohydrate concentration but elevated polyunsaturated fatty acids content. Green filtered light induced the lowest responses in metabolite and gene transcript levels, indicating that its photons are poorly absorbed by N. gaditana. Apart from some exceptions, the concentration of T. chuii metabolites either remained unaltered or decreased due to light quality change. The stronger effect was achieved under red filtered light, which caused significantly low response of several compounds, particularly amino acids. Least affected strain proved to be P. tricornutum which exhibited only a few significant changes of the identified metabolites. Although, it was the only microalga which demonstrated modified content of many fatty acids under monochromatic irradiance. By using only solar irradiance, light filtering could be proved a cost effective and easily applied method which can result in microalgal cells with the desirable biochemical and metabolic content without the need of specific illumination equipment. Future work will aim to optimize the illumination properties in the direction of biomass and metabolic productivity.

Τις τελευταίες δεκαετίες, τα μικροφύκη έχουν προσελκύσει το επιστημονικό ενδιαφέρον λόγω των πολυάριθμων πλεονεκτημάτων και εφαρμογών τους. Είναι πρωτογενείς παραγωγοί οξυγόνου για πολλούς οργανισμούς και καταλαμβάνουν τη βάση της τροφικής αλυσίδας. Η βελτιστοποίηση των παραμέτρων που ρυθμίζουν τη λειτουργία των κυττάρων αποτελεί κρίσιμο βήμα στην εκμετάλλευση τους. Πολλές νέες και προηγμένες τεχνολογίες βιοτεχνολογίας έχουν υιοθετηθεί ως εργαλεία για τον προσδιορισμό της προέλευσης, της φυσιολογίας, της κυτταρικής λειτουργίας και του μεταβολισμού τους. Στο πλαίσιο αυτό, διεξήχθησαν δύο πολλά υποσχόμενες προσεγγίσεις, η μέθοδος αλληλούχησης γονιδιώματος και η συνδυαστική ανάλυση ομικών τεχνολογιών, προκειμένου να εμπλουτιστούν οι υπάρχουσες γνώσεις για το θαλάσσιο φυτοπλαγκτόν. Το μεταβολικό πρότυπο των μικροφυκών, που παρουσιάζει ιδιαίτερο επιστημονικό ή/και εμπορικό ενδιαφέρον, θα μπορούσε να συμβάλει στην κατανόηση των κυτταρικών μηχανισμών τους που είναι το πρώτο βήμα της μεταβολικής μηχανικής. Οι ομικές τεχνολογίες αποτελούν σημαντική πηγή πληροφόρησης για την κατανόηση των κυτταρικών διεργασιών, ενώ η χρήση τους ως εργαλείο στη μελέτη της παραγόμενης βιομάζας και της κυτταρικής παραγωγικότητας των μικροφυκών αυξάνεται ραγδαία. Η έλλειψη αλληλουχιών γονιδιωμάτων μικροφυκών αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο για τη μελέτη της γονιδιακής ρύθμισης και της μεταβολικής απόκρισης. Με τη λογική αυτή, διεξήχθη η μέθοδος αλληλούχησης επόμενης γενιάς Illumina 2000 HiSeq για τον προσδιορισμό του πυρηνικού, πλαστιδιακού και μιτοχονδριακού γονιδιώματος του μικροφύκους Chlorella minutissima UTEX 2341. Πραγματοποιήθηκε de novo συναρμολόγηση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας χρησιμοποιώντας τους συναρμολογητές Velvet και Genious. Η πρόβλεψη των χλωροπλαστικών γονιδίων εκτελέστηκε ab initio με το λογισμικό Glimmer 3. Η ταυτοποίηση των γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον διακομιστή RAST (Rapid Annotation Subsystem Technology) και το κατατεθειμένο γονιδίωμα του Auxenochlorella protothecoides ως γονιδίωμα αναφοράς. Παραδόξως, η αλληλούχηση του γονιδιώματος και η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψαν ότι το στέλεχος UTEX 2341 χαρακτηρίζεται ουσιαστικά λανθασμένα ως Chlorella αφού φέρει εντυπωσιακή ομοιότητα με το Α. protothecoides. Η συναρμολόγηση είχε ως αποτέλεσμα το τελικό «πρόχειρο» γονιδίωμα με μέγεθος 32.7 Mb και κάλυψη γονιδιώματος 200x. Επιπλέον προσδιορίστηκαν τα γονιδιακά χαρακτηριστικά του μικροφύκους και πραγματοποιήθηκε χαρτογράφηση των γονιδίων με βάση τα υπάρχοντα αλληλουχημένα γονιδιώματα. Οι περιβαλλοντικές συνθήκες επηρεάζουν έντονα τόσο το μεταβολομικό όσο και το μεταγραφομικό πρότυπο των μικροφυκών, επηρεάζοντας τη σύνθεση πολυάριθμων χημικών ενώσεων με εφαρμογή στην φαρμακευτική, στην κοσμετολογία, στη διατροφή αλλά και στον τομέα των βιοκαυσίμων. Οι ιδιότητες του φωτός αποτελούν θεμελιώδεις παραμέτρους που επηρεάζουν όλους τους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς. Σε μια προσπάθεια ανίχνευσης των μεταβολών που σημειώνονται κατά τη διάρκεια της περιβαλλοντικής μεταβολής του φωτός, χρησιμοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη ομική προσέγγιση, ενώ τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές στατιστικές προσεγγίσεις. Στο πλαίσιο αυτό μελετήθηκε το μεταβολικό πρότυπο του μικροφύκους Α. protothecoides UTEX 2341 (πρώην C. minutissima) υπό διαφορετικές εντάσεις φωτός αλλά και υπό ερυθρή και κυανή μονοχρωματική ακτινοβολία για να προσδιοριστεί η μεταβολική απόκριση του στην ποσότητα και ποιότητα του παρεχόμενου φωτισμού. Σύμφωνα με την παρούσα μελέτη, ο μεταβολισμός του Α. protothecoides επηρεάζεται σημαντικά αυξάνοντας τα επίπεδα πολλών μεταβολιτών ως απόκριση στην ερυθρή μονοχρωματική ακτινοβολία αλλά και το παρατεταμένο σκότος. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μεταβολομική ανάλυση των οικονομικά σημαντικών στελεχών, Nannochloropsis gaditana, Tetraselmis chuii και Phaeodactylum tricornutum ανεπτυγμένων υπό ερυθρή, κυανή και πράσινη φιλτραρισμένη πηγή φωτός, με βάση την τεχνολογία GC-MS. Η φιλτραρισμένη ακτινοβολία χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ως εναλλακτική μέθοδος μεταβολής της ποιότητας ακτινοβολίας σε μικροφύκη αντί της μονοχρωματικής πηγής φωτός. Το λιπιδικό τους περιεχόμενο προσδιορίστηκε με ανάλυση GC-FID, ενώ αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα βασισμένη στην qPCR πραγματικού χρόνου για τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων του N. gaditana που εμπλέκονται στον πρωτογενή και δευτερογενή μεταβολισμό και τα αποτελέσματα συνδυάστηκαν με τη μεταβολομική ανάλυση. Ο φωτοσυνθετικός περιορισμός προκάλεσε μειωμένη κυτταρική πυκνότητα όλων των στελεχών υπό την φιλτραρισμένη ακτινοβολία σε σύγκριση με το πλήρες φάσμα. Κάθε στέλεχος αποκρίθηκε διαφορετικά αλλάζοντας τη χημική του σύνθεση ώστε να προσαρμοστεί στις νέες συνθήκες φωτός. Η σύγκριση των μεταγραφικών και μεταβολομικών αποτελεσμάτων αποκάλυψαν εκτεταμένες μεταβολικές προσαρμογές που προκλήθηκαν από την ποιότητα του φωτός στο N. gaditana. Στo Ν. gaditana, παρατηρήθηκε συνολική επαγωγή μεταγραφής γονιδίων και επιπέδων μεταβολιτών, που αφορούσαν κυρίως τo μεταβολισμό αμινοξέων. Η κυανή φιλτραρισμένη πηγή φωτός προκάλεσε μειωμένη συγκέντρωση υδατανθράκων, αλλά αυξημένη περιεκτικότητα σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Η πράσινη φιλτραρισμένη ακτινοβολία προκάλεσε τις χαμηλότερες αποκρίσεις μεταβολιτών και γονιδίων στο N. gaditana, γεγονός που υπο-δεικνύει ότι απορροφάται ανεπαρκώς από το συγκεκριμένο στέλεχος. Πέραν ορισμένων εξαιρέσεων, η συγκέντρωση των μεταβολιτών του μικροφύκους T. chuii είτε παρέμεινε στα ίδια επίπεδα είτε μειώθηκε με την μεταβολή της ποιότητας του φωτός. Ισχυρότερη επίδραση είχε το ερυθρό φιλτραρισμένο φως, το οποίο προκάλεσε σημαντικά χαμηλή απόκριση αρκετών μεταβολιτών και ιδιαίτερα αμινοξέων. Λιγότερο επηρεασμένο στέλεχος αποδείχθηκε το P. tricornutum, το οποίο παρουσίασε ελάχιστες σημαντικές μεταβολές των αναγνωρισμένων μεταβολιτών. Εντούτοις, ήταν το μοναδικό μικροφύκος με τροποποιημένη περιεκτικότητα πολλών λιπαρών οξέων υπό τη μονοχρωματική ακτινοβολία. Χρησιμοποιώντας μόνο ηλιακή ακτινοβολία, το φιλτράρισμα φωτός θα μπορούσε να αποδειχθεί μια οικονομικά αποδοτική και τεχνικά εφαρμόσιμη μέθοδος σε εμπορικής κλίμακας καλλιέργειες όπως είναι οι μεγάλου όγκου βιοαντιδραστήρες μικροφυκών και μπορεί να οδηγήσει σε κύτταρα με το επιθυμητό βιοχημικό και μεταβολικό περιεχόμενο, χωρίς την ανάγκη εγκατάστασης απαιτητικού εξοπλισμού παροχής φωτός. Μελλοντικοί στόχοι της παρούσας έρευνας θα αποσκοπούν στη βελτιστοποίηση των ιδιοτήτων φωτισμού προς την κατεύθυνση της βιομάζας και της μεταβολικής παραγωγικότητας.