Βιοχημικές μελέτες στο μεταβολισμό του γλυκογόνου

Abstract

Glycogen is a branched polymer consisting of glucose monomers and serves as glucose storage for the body. It has been shown that glycogenolysis increases the blood glucose levels in type 2 diabetes (T2D) patients even more and therefore several studies have validated glycogen metabolism enzymes as pharmaceutical targets for T2D treatment. Glycogen degradation occurs mainly, by the action of glycogen phosphorylase (GP) and glycogen debranching enzyme (GDE). GP catalyzes glycogen breakdown but its action halts four residues from a branch point. GDE removes the branched residues and GP can further degrade glycogen. GP has been studied through structure based inhibitor design to discover small molecules that could serve as anti-hyperglycaemic agents for T2D patients. Among GP’s binding sites, the catalytic site has been studied in depth with glucose derivatives but less is known for the inhibitor binding site. Herein, we studied four inhibitor collections targeting the catalytic site and one collection of chrysin analogues targeting the inhibitor binding site. The first collection included (S) and (R) epimers of glucopyranosylidene-spiro-imidazolinones as inhibitors of human liver GP (hlGP). (R) spiro-epimers were found to be more potent than the corresponding (S) spiro-epimers. The most potent compound was 2-naphthyl-substituted (R)-imidazolinone 30 (Ki = 1.72 μΜ) and X-ray crystallography revealed that only the (R) epimers were bound in the catalytic site of GP. Furthermore, complex structures revealed the structural basis of inhibition in comparison with other glucopyranosylidene-spiro-heterocycles. In the second collection of glucose derivatives; we evaluated C-β-D-glucopyranosyl -thiazoles, -imidazoles and an N-β-D glucopyranosyl –tetrazole as inhibitors of hlGPa. The most potent compound was 2-naphthyl-substituted –imidazole 9 (Ki = 3.2 μΜ). C-β-D-glucopyranosyl –thiazoles were less potent than the corresponding –imidazoles whereas N-β-D glucopyranosyl –tetrazole was the less potent inhibitor studied in this section. X-ray crystallography revealed crucial interactions with His377 main chain carbonyl oxygen, located at the catalytic site of GP. In the third collection of glucose derivatives, we tested β‑D‑Glucosaminyl triazoles as inhibitors of hlGPa. In these series, the 2′-OH of the glucose unit was replaced by -NH2 group (glucosamines). The most potent compound was the 2-naphthyl-substituted 29b (Κi = 7.6 μΜ) which is classified among the top three most potent inhibitors for the catalytic site of GP with a modified glucopyranosyl ring discovered thus far. Moreover, we observed that glucose modification had a negative effect in the inhibitory potency but these inhibitors where still potent against GP, in comparison with previous reported inhibitors with modifications of the glucose unit. In the fourth collection, we assessed the characteristics of the β-pocket of the catalytic site of GP by the binding of C-β-D-glucopyranosyl –triazoles. The most potent compound was CK900 (Ki = 427 nM) which was found bound at the catalytic site of GP. X-ray crystallography revealed hydrophilic and hydrophobic regions in the β-pocket that can be used for further rational inhibitor design. Finally, we studied the inhibitor binding site of GP with chrysin analogues (Ki = 7.6 μΜ). Kinetic experiments showed that the most potent compound, 43, displayed a Ki of 1.0 µM, similar to flavopiridol. Kinetic studies and X-ray crystallography revealed that these inhibitors bind at the inhibitor site of GP and offered insights for the next steps in the structure based inhibitor design process. In addition to GP, we studied human Glycogen Debranching Enzyme (hGDE). There is no reference available for hGDE production in E. coli and the only known structure for eukaryotic GDE comes for Candida glabrata (CgGDE). We tried to produce and fold the protein in the periplasm and the cytoplasm of bacterial strains of E. coli. Regarding periplasmatic localization, the amounts of hGDE folded in that area were not enough for structural studies. Focusing in the cytoplasmatic space, we tried to enhance protein folding, stability and solubility using different E. coli strains and lysis buffers. Unfortunately, we didn’t manage to produce soluble hGDE. Co-expression with molecular chaperones resulted in soluble protein production. Fast protein liquid chromatography was used to separate the active from the inactive protein form. The molecular chaperone trigger factor led to high soluble protein production but co-expression with molecular chaperones GroES/EL led to less amounts of soluble protein but with higher enzymatic activity. Kinetic studies revealed that hGDE follows the Michaelis-Menten kinetics and it reaches maximum activity at 37 οC at pH 6.0. Finally, we manage to grow protein crystals at 16 οC in two different conditions (0.1 M Tris-HCl pH 8.8, 10 % w/v PEG4000 και 0.1 M Hepes-NaOH pH 7.5, 12 % w/v PEG8000). Besides hGDE, we also purified CgGDE establishing a new protocol using affinity chromatography and a β-CD sepharose 6B column. Crystals of CgGDE were grown in a novel condition (0.1 M Hepes-NaOH pH 7.5, 10 % (v/v) 2-propanol, 20 % w/v PEG4000).

Το γλυκογόνο είναι ένα διακλαδισμένο πολυμερές γλυκόζης το οποίο αποτελεί μια αποθήκη ενέργειας για τον οργανισμό. Σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ (ΣΔ2) έχει βρεθεί ότι η ρύθμιση της γλυκογονόλυσης είναι ανεπαρκής με συνέπεια την αύξηση των επίπεδων του σακχάρου στο αίμα. Έτσι, έχει προταθεί τα ένζυμα του μεταβολισμού του γλυκογόνου να αποτελέσουν μοριακούς στόχους για την εύρεση φαρμάκων για τον ΣΔ2. Ο καταβολισμός του γλυκογόνου γίνεται με τη συντονισμένη δράση δύο ενζύμων, της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου (GP) και του ενζύμου αποδιακλάδωσης του γλυκογόνου (GDE). Η GP καταλύει τη σταδιακή απομάκρυνση καταλοίπων γλυκόζης από το μακρομόριο του γλυκογόνου μέχρι ένα σημείο διακλάδωσης, το οποίο διασπά το GDE ώστε να μπορέσει η GP να συνεχίσει τη δράση της. Η GP βρίσκεται στο κέντρο του κατευθυνόμενου από τη δομή σχεδιασμού ενώσεων οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την φαρμακευτική αντιμετώπιση του ΣΔ2. Ανάμεσα στα κέντρα πρόσδεσης του ενζύμου, το καταλυτικό είναι αυτό που έχει μελετηθεί περισσότερο, κυρίως με ανάλογα γλυκόζης, ενώ λίγα είναι γνωστά για τις ιδιότητες του κέντρου αναστολής. Στη διδακτορική διατριβή μελετήσαμε 4 διαφορετικές κατηγορίες αναλόγων γλυκόζης στοχεύοντας το καταλυτικό κέντρο και μια κατηγορία αναλόγων χρυσίνης στοχεύοντας το κέντρο αναστολής. Στην πρώτη κατηγορία αναλόγων γλυκόζης, μελετήσαμε τα (S) και (R) επιμερή γλυκοπυρανοσιλιδενο-σπείρο-ιμιδαζολινονών ως αναστολείς της hlGP. Βρέθηκε ότι τα (R) σπείρο-επιμερή ήταν πιο ισχυροί αναστολείς από τα αντίστοιχα (S) και ο πιο ισχυρός αναστολέας ήταν ο 30 (Ki = 1.72 μΜ) ο οποίος διέθετε μια ομάδα 2-ναφθαλενίου. Κρυσταλλογραφικές μελέτες ακτίνων-Χ έδειξαν ότι μόνο τα (R) επιμερή προσδένονται στο καταλυτικό κέντρο της GP. Επιπλέον, οι πληροφορίες από τις δομές έδωσαν μια εξήγηση για τις διαφορές στην ισχύ της αναστολής συγκριτικά με άλλες σπείρο-κυκλικές ενώσεις. Στη δεύτερη κατηγορία αναλόγων γλυκόζης, μελετήσαμε ανάλογα C-β-D-γλυκοπυρανόσυλο -θειαζολών, -ιμιδαζολών και μιας N-β-D γλυκοπυρανόσυλο–τετραζόλης ως αναστολείς της hlGP. Ο πιο ισχυρός αναστολέας ήταν η C-β-D-γλυκοπυρανόσυλο-ιμιδαζόλη 9 (Ki = 3.2 μΜ) η οποία είχε ως υποκαταστάτη στον ιμιδαζολικό δακτύλιο μια 2-ναφθαλενομάδα. Οι γλυκοπυρανόσυλο-θειαζόλες βρέθηκαν να είναι ασθενέστεροι αναστολείς από τις αντίστοιχες γλυκοπυρανόσυλο-ιμιδαζόλες ενώ η N-β-D γλυκοπυρανόσυλο–τετραζόλη ήταν ο πλέον ασθενέστερος αναστολέας από αυτή τη κατηγορία ενώσεων. Η εφαρμογή κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ ανέδειξε τη σημασία του δεσμού υδρογόνου μεταξύ του δακτυλίου του ιμιδαζολίου και του οξυγόνου του καρβονυλίου της κύριας αλυσίδας της His377. Στην τρίτη κατηγορία ενώσεων, μελετήθηκαν ανάλογα C-β-γλυκοσάμινιλ-τριαζόλης ως αναστολείς της hlGPa. Οι ενώσεις αυτές είχαν τροποποιημένο το δακτύλιο της γλυκοπυρανόζης καθώς η ομάδα -ΟΗ στη θέση 2’ είχε αντικατασταθεί από μια ομάδα –ΝΗ2 (γλυκοζαμίνες). Ο πιο ισχυρός αναστολέας ήταν ο 29b (Κi = 7.6 μΜ) ο οποίος έφερε ως υποκαταστάτη μια ομάδα 2-ναφθαλενίου και κατατάσσεται μέσα στις πέντε πιο ισχυρές ενώσεις ως προς την GP με τροποποιημένο δακτύλιο γλυκοπυρανόζης που προσδένονται στο καταλυτικό της κέντρο. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η αντικατάσταση της ομάδας 2’ –ΟΗ της γλυκοπυρανόζης από –ΝΗ2 αν και έχει μια αρνητική επίδραση στη σταθερά αναστολής, οι νέες ενώσεις εξακολουθούσαν να είναι αρκετά ισχυροί αναστολείς της GP, σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες. Στην τέταρτη κατηγορία ενώσεων, μελετήσαμε τις ιδιότητες της β-εσοχής του καταλυτικού κέντρου της GP μέσω της σύνδεσης C-β-D-γλυκοπυρανόσυλο-τριαζολικών ενώσεων. Ο πιο ισχυρός αναστολέας ήταν ο CK900 (Ki = 427 nM) και η εφαρμογή κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ έδειξε ότι οι ενώσεις βρέθηκαν προσδεδεμένες στο καταλυτικό κέντρο της GP. Η ανάλυση των δομών των συμπλόκων ανέδειξε τις υδρόφοβες και υδρόφιλες περιοχές, των οποίων οι αλληλεπιδράσεις με τους αναστολείς μπορούν να αυξήσουν ή να εξασθενίσουν την ισχύ τους. Τέλος, μελετήσαμε το κέντρο αναστολής της GP μέσα από τη σύνδεση σε αυτό αναλόγων χρυσίνης. (Ki = 7.6 μΜ). Κινητικές μελέτες έδειξαν ο πιο ισχυρός αναστολέας ήταν ο 43 (Ki = 1.0 µM) ο οποίος εμφανίζεται σχεδόν ισοδύναμος με τη φλαβοπιριδόλη, τον πιο ισχυρό αναστολέα για το κέντρο αναστολής της GP. Κινητικές και κρυσταλλογραφικές μελέτες έδειξαν την πρόσδεση των αναστολέων στο κέντρο αναστολής του ενζύμου και προσέφεραν τις πληροφορίες για τα επόμενα βήματα στον κατευθυνόμενο από τη δομή σχεδιασμό ενώσεων. Εκτός από τη GP μελετήσαμε και το ανθρώπινο GDE (hGDE) για το οποίο δεν υπάρχει αναφορά στη βιβλιογραφία για παραγωγή του στο E. coli. Η μόνη διαθέσιμη κρυσταλλική δομή για ευκαρυωτικό GDE προέρχεται από τον οργανισμό Candida glabrata (CgGDE). Έγιναν δοκιμές παραγωγής και αναδίπλωσης της πρωτεΐνης στο περίπλασμα και στο κυτταρόπλασμα του E. coli. Σε ό,τι αφορά το περίπλασμα, έγιναν προσπάθειες αναδίπλωσης του hGDE σε αυτό το χώρο αλλά οι ποσότητες που παρήχθησαν δεν ήταν επαρκής για δομικές μελέτες. Σε ό,τι αφορά το κυτταρόπλασμα, έγιναν δοκιμές παραγωγής του hGDE σε διαφορετικά στελέχη E. coli με χρήση διαφορετικών διαλυμάτων λύσης, χωρίς να παρατηρηθεί παραγωγή διαλυτής πρωτεΐνης. Συν-έκφραση με μοριακές συνοδούς οδήγησε σε παραγωγή ικανοποιητικών ποσοτήτων διαλυτού hGDE το οποίο απομονώθηκε σε υψηλή βιοχημική καθαρότητα. Επιπλέον, επετεύχθη ο διαχωρισμός της δραστικής από τη μη δραστική πρωτεΐνη μέσω ταχείας υγρής χρωματογραφίας πρωτεϊνών. Η χρήση της μοριακής συνοδού trigger factor οδήγησε σε μεγάλη παραγωγή διαλυτού hGDE, αλλά η χρήση των μοριακών συνοδών GroES/EL οδήγησε σε παραγωγή λιγότερης αλλά πιο δραστικής πρωτεΐνης. Κινητικές μελέτες έδειξαν ότι το ένζυμο ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten και παρουσιάζει μέγιστη δραστικότητα σε θερμοκρασία 37 οC σε pH 6.0. Τέλος, κρύσταλλοι του hGDE φαίνεται να αναπτύχθηκαν σε θερμοκρασία 16 οC σε δύο συνθήκες (0.1 M Tris-HCl pH 8.8, 10 % w/v PEG4000 και 0.1 M Hepes-NaOH pH 7.5, 12 % w/v PEG8000). Εκτός από το hGDE, απομονώσαμε το CgGDE με χρήση στήλης συγγένειας β-CD sepharose 6B και το κρυσταλλώσαμε σε μια καινούρια συνθήκη που δεν έχει περιγραφεί στη βιβλιογραφία. Σε περίπτωση που οι κρύσταλλοι του hGDE δεν περιθλούν ικανοποιητικά τις ακτίνες-Χ, τότε κρύσταλλοι του CgGDE μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εύρεση του τρόπου πρόσδεσης αναστολέων στο ένζυμο εφαρμόζοντας κινητικές μελέτες και στα δύο ένζυμα για λόγους σύγκρισης.