Ανάλυση φυτικών προϊόντων με προηγμένες μεθόδους και διερεύνηση της επίδρασής τους στην in vivo δραστικότητα του μεταβολικού ενζύμου CYP1A2

Abstract

Crocus sativus L., a perennial plant grown mainly around the Mediterranean and Iran, has many medicinal properties including anti-inflammatory, anti-depressive and cancer preventing properties. Aqueous herbal extracts may affect the activity of Phase I and II enzymes involved in xenobiotic metabolism. The present study was designed to: i) develop a reliable Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography (RP-HPLC) method for the determination of the in vivo CYP1A2 activity in saliva samples and ii) to examine the effect of C. sativus infusion intake on the activity of CYP1A2, CYP2A6, XO and NAT2 enzymes in humans. In order to address the second goal, caffeine and paraxanthine were isolated from saliva by liquid-liquid extraction (chlorophorm/isopropanol 85/15v/v). Extracts were analyzed by reversed-phase HPLC on a C18 column with mobile phase 0.1% acetic acid/methanol/acetonitrile (80/20/2 v/v) and detected at 273nm. Caffeine and paraxanthine elution times were <13min with no interferences from impurities or caffeine metabolites. Detector response was linear (0.10–8.00μg/ml, R2>0.99), recovery was >93% and bias <4.47%. Intra- and inter-day precision was <5.14% (n=6). The limit of quantitation was 0.10μg/ml and the limit of detection was 0.018±0.002μg/mL for paraxanthine and 0.032±0.002μg/ml for caffeine. Paraxanthine/caffeine ratio of 34 healthy volunteers was significantly higher in smokers (p<0.001). Saliva paraxanthine/caffeine ratios and urine metabolite ratios were highly correlated (r=0.85, p<0.001). The method can be used for the monitoring of CYP1A2 activity in clinical practice and in studies relevant to exposure to environmental and pharmacological xenobiotics. The second goal was addressed by recruiting thirty-four healthy volunteers who consumed for six days an infusion prepared from C. sativus stigmata. Enzyme phenotyping was assessed in saliva and urine using caffeine metabolite ratios as follows: CYP1A2: 17X/137Χ (saliva) and CYP1A2: (AFMU+1U+1X)/17U, CYP2A6: 17U/(17U + 17X), XO: 1U/(1U+1X) and NAT2: AFMU/(AFMU+1U+1X) (urine). Following C. sativus intake, CYP1A2 index was reduced by ∼13.7% in saliva (before: 0.51 ± 0.22, after: 0.44 ± 0.14; p=0.002) and ∼6.0% in urine (before: 3.81 ± 1.20, after: 3.58 ± 0.92; p=0.054). CYP1A2 index was significantly reduced only in males (saliva, before: 0.65 ± 0.22, after: 0.51 ± 0.16; p=0.0001; urine, before: 4.53 ± 1.19, after: 4.03 ± 0.87; p=0.017) suggesting sexual dimorphism in CYP1A2 inhibition. There was no effect of C. sativus intake on CYP2A6, XO or NAT2 indices. Short-term consumption of C. sativus infusion is unlikely to result in significant herb-drug interactions involving the enzymes studied, with the exception of potential herb-CYP1A2 substrate interaction in males.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του φυτικού προϊόντος «Κρόκος Κοζάνης» στην in vivo δραστικότητα ενζύμων μεταβολισμού των ξενοβιοτικών στον άνθρωπο, με την χρήση της καφεΐνης ως φαρμάκου-δείκτη, με τους εξής επιμέρους στόχους: i) ανάπτυξη μιας αξιόπιστης μεθόδου χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης (Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography, RP-HPLC) για τον προσδιορισμό της in vivo δραστικότητας του CYP1A2 στο σίελο και ii) διερεύνηση της επίδρασης του κρόκου στην in vivo δραστικότητα των ενζύμων CYP1A2, CYP2A6, XO και ΝΑΤ2 σε δείγματα ούρων και σιέλου. Λόγω της γνωστής σύστασης του προϊόντος, δεν έγινε ανάλυσή του με προηγμένες μεθόδους. Για την υλοποίηση του πρώτου στόχου, απομονώθηκε η καφεΐνη και η παραξανθίνη σε δείγματα σιέλου με εκχύλιση υγρού-υγρού με την χρήση διαλύματος χλωροφορμίου/ισοπροπανόλης 85/15 v/v. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία και ανιχνεύθηκαν στα 273 nm. Οι χρόνοι έκλουσης της καφεΐνης και της παραξανθίνης ήταν <13 λεπτά χωρίς παρεμβολές από άλλους μεταβολίτες της καφεΐνης. Η απόκριση της ανίχνευσης ήταν γραμμική (0,10–8,00μg/ml, R2>0.99), η ανάκτηση ήταν >93% και το bias <4.47%. Η ακρίβεια εντός σειράς και μεταξύ σειρών <5,14% (n=6). Το όριο ποσοτικού προσδιορισμού ήταν 0,10μg/ml και το όριο ανίχνευσης ήταν 0,018±0,002μg/mL για την παραξανθίνη και 0,032±0,002μg/ml για την καφεΐνη. Ο λόγος παραξανθίνης/καφεΐνης σε δείγμα 34 υγιών εθελοντών ήταν στατιστικά υψηλότερος σε καπνιστές (p<0,001). Επίσης, βρέθηκε υψηλή συσχέτιση του λόγου παραξανθίνης/καφεΐνης μεταξύ δειγμάτων σιέλου και δειγμάτων ούρων (r=0,85, p<0,001). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αναπτυχθείσα μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου CYP1A2 σε δείγματα σιέλου. Για την υλοποίηση του δεύτερου στόχου ελήφθησαν δείγματα σιέλου και ούρων από 34 μη-καπνιστές εθελοντές (20 γυναίκες και 14 άνδρες) οι οποίοι κατανάλωσαν εκχύλισμα κρόκου Κοζάνης για 6 ημέρες υπό περιορισμένη δίαιτα (κατά την διάρκεια της οποίας είχαν αποκλεισθεί τροφές που επηρεάζουν τα υπό μελέτη ένζυμα καθώς και τροφές που περιέχουν καροτενοειδή). Ο φαινότυπος των ενζύμων προσδιορίσθηκε σε δείγματα σιέλου και ούρων με την χρήση των παρακάτω μεταβολικών λόγων: CYP1A2: 17X/137Χ (σίελος) και CYP1A2: (AFMU+1U+1X)/17U, CYP2A6: 17U/(17U + 17X), XO: 1U/(1U+1X) και NAT2: AFMU/(AFMU+1U+1X) (ούρα). Μετά την κατανάλωση κρόκου, ο μεταβολικός λόγος για το CYP1A2 μειώθηκε κατά ~13,7% στα δείγματα σιέλου (προ-: 0,51 ± 0,22, μετά-: 0,44 ± 0,14; p=0,002) και ~6.0% στα δείγματα ούρων (προ-: 3,81 ± 1,20, μετά-: 3,58 ± 0,92, p=0,054). Ο μεταβολικός λόγος για το ένζυμο CYP1A2 μειώθηκε στατιστικά σημαντικά μόνο στο δείγμα των ανδρών (σίελος, προ-: 0,65 ± 0,22, μετά: 0,51 ± 0,16, p=0,0001 και ούρα προ-: 4,53 ± 1,19, μετά-: 4,03 ± 0,87, p=0,017) υποδηλώνοντας σεξουαλικό διμορφισμό στην αναστολή της δραστηριότητας του ενζύμου CYP1A2. Δεν υπήρξε επίδραση της κατανάλωσης κρόκου στους μεταβολικούς λόγους των ενζύμων CYP2A6, XO ή NAT2. Συμπεραίνεται ότι η βραχύχρονη κατανάλωση κρόκου Κοζάνης δεν αλληλεπιδρά με συγχορηγούμενα φάρμακα που μεταβολίζονται από τα ένζυμα που μελετήθηκαν, με εξαίρεση την πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ κρόκου και υποστρωμάτων του ενζύμου CYP1A2 στον ανδρικό πληθυσμό.