Development of molecular markers and assessment of diversity in populations of Pinus nigra in northeastern Greece

Abstract

The species Pinus nigra (black pine) comprises one of the most ecologically and economically important conifers encountered in southeastern Europe, Greece included. Even though it is not considered as a threatened species, specific sub-Mediterranean endemic black pine populations constitute priority habitats under the EU Natura 2000 directive (Habitat Directive no 92/43/CEE, May 21 1992).Its distribution, although rather broad, is particularly discontinuous and patchy, a fact that has provoked significant phenotypic, as well as genetic diversity among its various populations. This notion is reflected at the difficulties in adopting a generally accepted classification scheme for the species. Moreover, there exists confusion in the delimitation of the distribution range of autochthonous versus implanted Pinus nigra populations. Principal objective of this study was the employment of appropriate molecular markers in order to explore and record the genetic diversity of the species Pinus nigra at Perama, a region found at the boundaries of the prefectures of Evros and Rodopi (northeastern Greece). At the specific site, the population of black pine is encountered at a notably low elevation, compared to the vast majority of the rest populations of the species found in Greece, it exhibits distinguishing morphological features and at present, is imperilled due to the forthcoming establishment of gold mines at the region. For all these reasons, a comprehensive sampling was performed, covering the whole distribution range of the species at the particular site. Following, the genetic diversity of the species at Perama region was explored using a set of nuclear, chloroplast and mitochondrial markers, since the contrasted patterns of inheritance of organelle and nuclear genomes can allow the identification of the complexity of gene flow, which results in distinct distribution of genetic diversity within and among populations. The last part of the research involved the comparison of the genetic diversity of black pine found at Perama, with the genetic diversity of the species from six other locations in Greece, in particular Dadia (Evros), Thasos island, Falakro Mountain (Drama), Valia Calda (Pindos Mountains), Olympos Mountain and Parnon Mountain, employing the same set of molecular markers and techniques. The results of the study documented high genetic diversity and low differentiation among the studied populations, highlighting Mt Olympos and Valia Calda (Pindus Mountains) as regions of particular genetic significance. Simultaneously, Dadia revealed signs of inbreeding and genetic drift, possibly owing to the small population size, as well as the configuration of the forest and the isolation of the region from the rest of black pine populations in Greece. Furthermore, the fine-scale analysis conducted in Perama unravelled increased genetic diversity and high levels of variation among plots. iSSR data depicted a spatial geographic pattern defined by geological features of the particular area, while a specific group of Pinus nigra individuals was recognized as highly diverse. Interestingly, the site where this cluster of individuals is situated coincides with the area that has been proposed for deforestation in case of the goldmine establishment proceeds. Hence, these results should be taken into account in sustainable management practices in order to preserve the entire genetic variation of the species. This study, apart from its contribution to the delineation of the genetic diversity of Pinus nigra in Greece, a region that is expected to be seriously affected by the on-going climate change and witness severe floral rearrangements in the near future, has educed stimulating results that should be further investigated. It is noteworthy, that the present study is one of the first DNA molecular essays conducted in Greece concerning Pinus nigra, and also the first dealing with fine-scale analysis of the genetic parameters of the species in a particular region.

Το είδος Pinus nigra (μαύρη πεύκη) αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά κωνοφόρα τόσο από οικολογική όσο και από οικονομική σκοπιά, που φύονται στη νοτιοανατολική Ευρώπη, συμπεριλαμβανομένης και της Ελλάδας. Αν και δεν συγκαταλέγεται στα απειλούμενα είδη, κάποιοι ενδημικοί πληθυσμοί της Μεσογείου αποτελούν ενδιαιτήματα προτεραιότητας, σύμφωνα με την οδηγία Natura 2000 (Οδηγία 92/43/CEE, 21 Μαΐου 1992). Η κατανομή του είδους, αν και σχετικά μεγάλη, είναι ιδιαίτερα ασυνεχής και ανομοιογενής, γεγονός που έχει επιφέρει σημαντική φαινοτυπική αλλά και γενετική ποικιλομορφία στους επιμέρους πληθυσμούς του. Αυτό αποτυπώνεται στη δυσκολία ανεύρεσης και υιοθέτησης ενός κοινά αποδεκτού συστήματος ταξινόμησης για το είδος. Επιπροσθέτως, προβληματική είναι και η οριοθέτηση της εξάπλωσης των αυτόχθονων πληθυσμών μαύρης πεύκης σε σχέση με εκείνους που έχουν δενδροφυτευτεί εκ των υστέρων. Πρωταρχικό αντικειμενικό σκοπό της παρούσας έρευνας αποτέλεσε η ανεύρεση κατάλληλων μοριακών δεικτών για την εξερεύνηση και καταγραφή της γενετικής ποικιλότητας του είδους Pinus nigra στην περιοχή του Περάματος, στα όρια των νομών Έβρου-Ροδόπης (βορειοανατολική Ελλάδα). Στη δεδομένη περιοχή, ο συγκεκριμένος πληθυσμός ανευρίσκεται σε ιδιαίτερα χαμηλό υψόμετρο, συγκριτικά με την πλειοψηφία των υπολοίπων πληθυσμών της Ελλάδας, εμφανίζει ιδιόμορφα μορφολογικά χαρακτηριστικά και ταυτοχρόνως, επί της παρούσης, τίθεται σε κίνδυνο ενόψει της σχεδιαζόμενης εγκατάστασης ορυχείων εξόρυξης χρυσού. Για τους λόγους αυτούς έγινε εκτενής δειγματοληψία, καλύπτοντας ολόκληρο το εύρος εξάπλωσης του είδους στην περιοχή του Περάματος. Ακολούθως, διερευνήθηκε με μοριακές τεχνικές η γενετική του ποικιλομορφία, χρησιμοποιώντας διάφορους μοριακούς δείκτες, συγκεκριμένα πυρηνικούς, χλωροπλαστικούς και μιτοχονδριακούς, καθώς το διακριτό πρότυπο κληρονομικότητας ανάμεσα στο πυρηνικό γονιδίωμα και εκείνο των οργανιδίων, ενδέχεται να διαλευκάνει την πολυπλοκότητα της γονιδιακής ροής, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη διαφορετική κατανομή της γενετικής ποικιλότητας τόσο εντός όσο και ανάμεσα στους πληθυσμούς. Στο τελευταίο μέρος της μελέτης έγινε απόπειρα σύγκρισης της γενετικής ποικιλότητας που ανευρέθηκε στην περιοχή του Περάματος με τη γενετική ποικιλότητα που απαντάται σε πληθυσμούς μαύρης πεύκης σε άλλες έξι περιοχές της Ελλάδας, συγκεκριμένα στις περιοχές Δαδιά (Έβρος), νήσος Θάσος, Φαλακρό Όρος (Δράμα), Βάλια Κάλντα (Οροσειρά Πίνδου), Όρος Όλυμπος και Όρος Πάρνωνας, χρησιμοποιώντας τους ίδιους μοριακούς δείκτες και τεχνικές. Τα αποτελέσματα της έρευνας κατέγραψαν υψηλή γενετική ποικιλότητα και χαμηλή διαφοροποίηση μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών του είδους στην Ελλάδα, αναδεικνύοντας τις περιοχές Όλυμπος και Βάλια Κάλντα (Οροσειρά Πίνδου) ως περιοχές ιδιαίτερης γενετικής σημαντικότητας. Παράλληλα, η περιοχή της Δαδιάς εμφάνισε ενδείξεις ομομειξίας και γενετικής παρέκκλισης, πιθανότατα λόγω του μικρού μεγέθους του πληθυσμού, καθώς και της συγκεκριμένης διαμόρφωσης του δάσους και της απομόνωσης της περιοχής από όλες τις υπόλοιπες περιοχές όπου φύεται μαύρη πεύκη στην Ελλάδα. Επιπροσθέτως, η μικρής κλίμακας ανάλυση στην περιοχή του Περάματος αποκάλυψε αυξημένη γενετική ποικιλομορφία καθώς και υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων του πληθυσμού. Τα πορίσματα των αναλύσεων με βάση τους δείκτες iSSR ανέδειξαν χωρικό γεωγραφικό πρότυπο οριζόμενο πιθανώς από γεωμορφολογικές ιδιομορφίες της περιοχής, ενώ μια συγκεκριμένη ομάδα ατόμων μαύρης πεύκης χαρακτηρίστηκε ως ιδιαζόντως ποικιλόμορφη. Ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι το σημείο όπου εντοπίζεται ο συγκεκριμένος πυρήνας δένδρων ταυτίζεται με την περιοχή εκείνη που έχει προταθεί προς αποψίλωση, στην περίπτωση που η εγκατάσταση των ορυχείων τελικώς πραγματοποιηθεί. Είναι εύλογο οπότε, ότι τα αποτελέσματα αυτά θα πρέπει να ληφθούν σοβαρά υπόψη κατά το σχεδιασμό στρατηγικών βιώσιμης διαχείρισης, με απώτερο σκοπό τη διατήρηση του συνόλου της γενετικής ποικιλότητας στην περιοχή. Η παρούσα μελέτη, πέραν της συνεισφοράς στην ανάδειξη και καταγραφή της γενετικής ποικιλότητας του είδους Pinus nigra στην Ελλάδα, μια περιοχή που εικάζεται ότι θα επηρρεαστεί σοβαρά από την κλιματική αλλαγή και θα υποστεί σημαντικές χλωριδικές ανακατατάξεις στο κοντινό μέλλον, έχει εκμαιεύσει εξαιρετικά ενδιαφέροντα αποτελέσματα που χρήζουν προσοχής και περαιτέρω διερεύνησης. Καταλήγοντας, πρέπει τέλος να τονιστεί ότι η παρούσα προσπάθεια αποτελεί μια από τις πρώτες μελέτες με μοριακούς δείκτες DNA για τη μαύρη πεύκη στην Ελλάδα, καθώς και η πρώτη που σχετίζεται με μικρής κλίμακας ανάλυση των γενετικών παραμέτρων του είδους σε μια συγκεκριμένη περιοχή.