Anticalcification potential of heparin hydrogel on glutaraldehyde fixed bovine pericardial tissues

Abstract

Valvular heart disease remains common in industrialized countries, because of the decrease in prevalence of rheumatic heart diseases has been accompanied by an increase in that of degenerative valve diseases. Different current available prostheses are being introduced as treatment mainly categorized into mechanical or bioprosthetic replacement valves. Both show different pros and cons. A relatively newly proposed treatment for such diseases is tissue engineered heart valves, which still shows some drawbacks mainly calcification. The calcification process consists in the development of calcific deposits on the tissues because of the fact that blood serum is highly supersaturated with respect to calcium phosphate mineral phases. Calcification of tissues may thus be minimized or prevented by the use of anticalcifying agents, i.e. molecules that have the ability to regulate nucleation and/or crystal growth processes. Among different possible anticalcification treatments heparin hydrogel has been selected as the one for our work. Heparin hydrogel offers good space filling material for biological application, charge neutralization of the scaffold in addition to this, cardiologists have a good experience with different effects of heparin for such kind of heart valve replacement surgeries. The work was divided into two main parts: a) Heparin was tested for its effect on the growth of hydroxyapatite (HAP) crystals using Ca/P corresponding to those for supersaturation of HAP. The mechanism of action was further investigated using isotherm adsorption experiment to understand the nature of this inhibition mechanism. b) Heparin was functionalized with thiol group and used to prepare hydrogel, the successfully prepared hydrogel was used as treatment for glutaraldehyde bovine pericardial tissues and calcification potential was tested using constant composition model. The experiments were run under octacalcium phosphate (OCP) supersaturation physiological conditions and the results were analysed histologically, mechanically and using constant composition (CC) model. For the first part of the work, Heparin in calcium phosphate solutions showed a clear retardation for the crystal growth process. The inhibition was attributed to adsorption and blockage of the active crystal growth sites and was confirmed by quantitative measurements of the respective adsorption isotherms. For the second part, stable heparin hydrogel was successfully prepared and characterized. Also, the heparin hydrogel treated-glutaraldehyde bovine pericardial tissues (GBPT) showed a clear retardation for the inhibition. Results were confirmed using histological techniques.

Η νόσος των βαλβίδων της καρδιάς εξακολουθεί να είναι κοινός στις βιομηχανικές χώρες, λόγω που η πτώση της συχνότητας των νόσων της ρευματικής καρδιάς συνοδεύεται με την αύξηση στις εκφυλιστικές παθήσεις των βαλβίδων. Διάφορες τρέχουσες διαθέσιμες προσθέσεις εισάγονται ως θεραπεία που ταξινομείται κυρίως σε μηχανικές ή βιοπροθετικές βαλβίδες αντικατάστασης. Και οι δύο παρουσιάζουν διαφορετικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Ακόμα ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα που αντιμετωπίζει η βιοπροσθετική αντικατάσταση είναι η ασβεστοποίηση. Η διαδικασία ασβεστοποίησης συνίσταται στην ανάπτυξη ασβεστολιθικών εναποθέσεων στους ιστούς λόγω του γεγονότος ότι ο ορός αίματος είναι υπερβολικά κορεσμένος σε σχέση με τις κρυσταλλικές φάσεις του φωσφορικού ασβεστίου. Στη βιβλιογραφία έχουν περιγραφεί διάφοροι μηχανισμοί ασβεστοποίησης. α) κυτταρικός που περιλαμβάνει κυτταρικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα όπως η οστεογονική διαφοροποίηση και μετασχηματισμός και β) ακυτταρικός μηχανισμός ο οποίος είναι καθαρή φυσικοχημική διαδικασία που ελέγχεται κυρίως από τη θερμοκρασία, ρΗ, υπερκορεσμό και την παρουσία ακαθαρσιών. Για τη μελέτη αυτών των μηχανισμών, έχουν προταθεί διαφορετικά in vivo και in vitro μοντέλα στη βιβλιογραφία. Παρόλο που τα μοντέλα in vivo, όπου είναι ευρέως αποδεκτά το μεγάλο χρονικό διάστημα που απαιτείται για τη μελέτη, το κόστος, τα δεοντολογικά ζητήματα και τέλος η δυσκολία απομόνωσης μιας παραμέτρου για να μελετηθεί χωριστά αναφέρονται στην ανάγκη για πιο ικανοποιητικά μοντέλα. Στην βιβλιογραφία αναφέρεται η χρήση διαφορετικών in vitro μοντέλων (και μερικά από αυτά εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται). Η μείωση της συγκέντρωσης των χρησιμοποιούμενων ειδών ιόντων κατά τη διάρκεια του πειράματος οδήγησε σε μείωση του υπερκορεσμού του χρησιμοποιούμενου διαλύματος και επεσήμανε την ανάγκη για μοντέλα ασβεστοποίησης σταθερής σύνθεσης. Σε τέτοια διαλύματα ασβεστοποίησης (κυρίως ασβέστιου και φωσφορικών ιόντων ορισμένου υπερκορεσμού που αντιστοιχούν στις ανθρώπινες φυσιολογικές τιμές) οι συγκεντρώσεις διατηρούνται σταθερές κατά τη διάρκεια του πειραματικού χρόνου χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδιο ρΗ για να παρακολουθούν οποιαδήποτε αλλαγή στο ρΗ (που είναι ένας δείκτης για την ανάπτυξη κρυστάλλων) και μηχανισμό ανατροφοδότησης, αναπληρώνοντας τις ποσότητες που αναλώνονται ώστε να διατηρείται σταθερό το ρΗ και ο υπερκορεσμός. Έχουν προταθεί μέχρι τώρα πολλοί παράγοντες που δρουν κατά της ασβεστοποίησης, συμπεριλαμβανομένων διφωσφονικών, αμινο ελαϊκού οξέος, κατιόντων μετάλλων ή επιφανειοδραστικών ουσιών. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) έχουν βρεθεί ότι καταλύουν την πυρήνωση και την κρυσταλλική ανάπτυξη ανθρακικού ασβεστίου από φυσιολογικά διαλύματα ασβεστίου. Ωστόσο, έχει επίσης βρεθεί ότι παρεμπόδισαν την ανάπτυξη κρυστάλλου υδροξυαπατίτη (ΗΑΡ) από υπερκορεσμένα διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου σε συνθήκες σταθερού υπερκορεσμού. Ειδικότερα, δείχθηκε ότι η έκταση της αναστολής εξαρτάται από την αρχική δομή των GAGs και από τον αριθμό και τη θέση των θειικών ομάδων. Μεταξύ των GAG, η ηπαρίνη κατέχει την υψηλότερη πυκνότητα αρνητικού φορτίου στην εξωκυττάρια ουσία (ECM) και το μόριο της αποτελείται από τρία σάκχαρα, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, D-γλυκουρονικό οξύ και L-ιδουρονικό οξύ. Το υψηλό αρνητικό φορτίο οφείλεται στην παρουσία τόσο καρβοξυλικών όσο και θειικών ομάδων στο μόριό της. Η ασβεστοποίηση των ιστών μπορεί συνεπώς να ελαχιστοποιηθεί ή να αποφευχθεί με τη χρήση παραγόντων αντι-ασβεστοποιήσης, δηλαδή μορίων που έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν τις διαδικασίες σχηματισμού πυρηνοποιήσεων και/ή κρυστάλλων. Μεταξύ των διαφόρων πιθανών τεχνικών αντιμετώπισης της ασβεστοποιήσης, η υδροπηκτή (hydrogel) ηπαρίνης έχει επιλεγεί στην εργασία μας. Η υδροπηκτή της ηπαρίνης προσφέρει καλό υλικό πλήρωσης χώρου για βιολογική εφαρμογή και εξουδετέρωση φορτίου του υποστρώματος. Επιπλέον, υπάρχει σημαντική κλινική εμπειρία με διαφορετικές επιδράσεις της ηπαρίνη για στο καρδιοαγγειακό κυκλοφορικό σύστημα. Η εργασία χωρίστηκε σε δύο βασικά μέρη: α) Η ηπαρίνη δοκιμάστηκε για την επίδρασή της στην ανάπτυξη κρυστάλλων υδροξυαπατίτη (ΗΑΡ) χρησιμοποιώντας Ca/P που αντιστοιχούν σε εκείνους για υπερκορεσμό της HAP. Ο μηχανισμός δράσης διερευνήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας πείραμα ισόθερμης προσρόφησης για να κατανοηθεί η φύση αυτού του μηχανισμού αναστολής. β) Η ηπαρίνη ενεργοποιήθηκε με ομάδα θειόλης και χρησιμοποιήθηκε για να παρασκευαστεί υδρογέλη. Η επιτυχώς παρασκευασθείσα υδρογέλη χρησιμοποιήθηκε ως τεχνική εμποτισμού για τους περικαρδιακούς ιστούς βοοειδών μονιμοποιημένων με γλουταραλδεΰδη και το δυναμικό ασβεστοποίησης in vitro δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας μοντέλο σταθερής σύνθεσης. Τα πειράματα διεξήχθησαν υπό φυσιολογικές συνθήκες υπερκορεσμού φωσφορικού οκτασβεστίου (OCP) και αναλύθηκαν ιστολογικά, μηχανικά και με χρήση μοντέλου σταθερής σύνθεσης. Για το πρώτο μέρος της εργασίας, η ηπαρίνη σε διαλύματα φωσφορικού ασβεστίου έδειξε μια σαφή επιβράδυνση στη διαδικασία ανάπτυξης κρυστάλλων. Η αναστολή αποδόθηκε στην προσρόφηση και στην απόφραξη των θέσεων ανάπτυξης ενεργών κρυστάλλων και επιβεβαιώθηκε με ποσοτικές μετρήσεις των αντίστοιχων ισόθερμων προσρόφησης. Για το δεύτερο μέρος, παρασκευάστηκε και χαρακτηρίστηκε επιτυχώς μια σταθερή υδροπηκτή ηπαρίνης. Ο εμποτισμός με υδροπηκτή ηπαρίνης δεν μετέβαλε την κλινικά αποδεκτή μηχανική συμπεριφορά του μονιμοποιημένου βόειου περικαρδιακού ιστού. Τέλος, η επεξεργασία GBP με υδροπηκτή ηπαρίνης έδειξε μία σαφή επιβράδυνση στην ασβεστοποίηση του GBP. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ιστολογικές τεχνικές. Τα αποτελέσματα έδειξαν υποσχόμενο μέλλον για την υδροπηκτή της ηπαρίνης ως τεχνική αντιμετώπισης της ασβεστοποιήσης των βιοπροσθετικών καρδιακών βαλβίδων.