Πειραματική μελέτη της δράσης του εκχυλίσματος του φυτού Crocus Sativus Linneaus σε κακοήθη γλοιώματα του εγκεφάλου

Abstract

Gliomas are the most common malignant tumours of the brain and glioblastoma multiforme (GBM) is the most frequent over the age of 55 years of old. The median survival of GBM patients is 9-15 months, while the overall 5-year survival is approximately 5,6%. The 5-year survival in the group below the age of 20 years is as low as 16,6%. In this research project, the crude extract of Crocus Sativus Linneaus has been tested for its anti-cancerous activity in C6 glioma cell line and secondly for its potential as an anticancer agent when administered in an orthotopic rat glioma model via the technique of convection enhanced delivery (CED). Primary targets: 1) in vitro confirmation of the anti-cancerous activity of crude extract of Crocus Sativus Linneaus against C6 glioma cell line, 2) the investigation of its anti-cancerous activity in an in vivo rat glioma model via the technique of CED. Secondary targets: 1) the in vitro titration of Crocus Sativus Linneaus as an antineoplastic agent for glioma, 2) the investigation of the mechanism of action of Crocus Sativus Linneaus crude extract, 3) the combinational study of the Crocus Sativus Linneaus crude extract and the approved chemotherapeutic agent temozolomide (TMZ), 4) the establishment of an orthotopic rat glioma model with C6 cell line, and 5) the application of convection enhanced delivery in an in vivo rat glioma model. Our study demonstrated that Crocus Sativus Linneaus crude extract inhibits in vitro C6 cell proliferation and exhibits synergistic action with temozolomide, achieving the same results in C6 cells with a reduced TMZ dose in their combination. CSL causes a non-apoptotic calpain dependent death in C6 rat glioma cells, combined possibly with autophagy. Although the in vivo glioma C6 model was developed both subcutaneously and orthotopically in SCID BALB/c mice, it was not developed orthotopically in Wistar rats. Finally, the CED technique of the macro-molecular Crocus Sativus Linneaus crude extract has been successfully applied without perioperative complications. We conclude that Crocus Sativus L. crude extract can reduce cell viability of the C6 glioma cell line. The combination of the extract with the alkylating agent temozolomide can improve the antineoplastic effect even with lower dose of temozolomide. C6 cell death was induced by a non-apoptotic calpain-dependent death. The immunogenicity of C6 glioma cell line in an orthotopic in vivo glioma model in Wistar rats was confirmed according to a few studies in the literature, whereas the C6 glioma model was developed successfully in immunocompromised mice. The administration of macromolecular substances with the help of CED is safe, does not present major technical difficulties, and achieves sufficient concentric intraparenchymal infiltration around the catheter. CED offers a new route of administration of macromolecules in the brain bypassing the blood-brain-barrier and limiting systematic adverse effects.

Τα γλοιώματα αποτελούν τους συχνότερους κακοήθεις όγκους του εγκεφάλου με το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα να είναι το συχνότερο στις ηλικίες άνω των 55 ετών. Η μέση επιβίωση των ασθενών με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα είναι 9-15 μήνες, ενώ η πενταετής επιβίωση για το σύνολο των ασθενών είναι 5,6%. Η πενταετής επιβίωση των ασθενών κάτω των 20 ετών είναι 16,6%. Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η παρακάτω υπόθεση: το ακατέργαστο εκχύλισμα του Crocus Sativus Linneaus (CSL) εμφανίζει αντικαρκινικές ιδιότητες εναντίον της C6 κυτταρικής σειράς κακοήθους γλοιώματος και δύναται να χορηγηθεί με την τεχνική της ενισχυμένης μεταγωγικής χορήγησης (Convection Enhanced Delivery, CED) σε ζωικό πρότυπο εμφυτευμένων καρκινικών κυττάρων κακοήθους γλοιώματος στον εγκέφαλο επίμυων. Πρωτεύοντες στόχοι: 1) η τεκμηρίωση της αντικαρκινικής ιδιότητας του ακατέργαστου εκχυλίσματος του CSL στις in vitro καλλιέργειες των C6 καρκινικών κυττάρων γλοιώματος, 2) η ανάδειξη της αντικαρκινικής ιδιότητας του ακατέργαστου εκχυλίσματος CSL σε in vivo ζωικό πρότυπο γλοιώματος, μέσω της τεχνικής της CED. Δευτερεύοντες στόχοι: 1) η τιτλοποίηση της δοσολογίας του ακατέργαστου εκχυλίσματος του CSL για την αντικαρκινική του δράση στις in vitro καλλιέργειες των C6 καρκινικών κυττάρων κακοήθους γλοιώματος, 2) η ανεύρεση του μηχανισμού δράσης του ακατέργαστου εκχυλίσματος του CSL, 3) η ανάδειξη του τρόπου αλληλεπίδρασης του ακατέργαστου εκχυλίσματος του CSL με την εγκεκριμένη χημειοθεραπευτική φαρμακευτική ουσία τεμοζολομίδη (ΤΜΖ) κατά τη συνδυαστική χορήγησή τους, 4) η δημιουργία ενός ορθοτοπικού ζωικού προτύπου σε επίμυες με την καρκινική κυτταρική σειρά C6, και 5) η εφαρμογή της μεθόδου της CED σε in vivo ζωικά πρότυπα γλοιώματος. Από τη μελέτη μας καταδείχθηκε ότι το ακατέργαστο εκχύλισμα του CSL σε μεγάλες συγκεντρώσεις αναστέλλει in vitro τον πολλαπλασιασμό των C6 κυττάρων και παρουσιάζει συνεργική δράση με την ΤΜΖ, επιτυγχάνοντας το ίδιο αποτέλεσμα με μικρότερη συγκέντρωση της ΤΜΖ. Ο μηχανισμός αντικαρκινικής δράσης του ακατέργαστου εκχυλίσματος είναι η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου εξαρτώμενου από το μονοπάτι μεταγωγής σήματος των καλπαϊνών, συνδεδεμένου πιθανόν με την αυτοφαγία. Η προσπάθεια ανάπτυξης ορθοτοπικού ζωικού προτύπου γλοιοβλαστώματος με εμφύτευση C6 κυττάρων σε επίμυες Wistar απέβη αρνητική, σε αντίθεση με την υποδόρια εμφύτευση των κυττάρων C6 σε ανοσοκατεσταλμένους μύες SCID BALB/c, η οποία απέβη θετική. Τέλος, η τεχνική της ενισχυμένης μεταγωγικής χορήγησης του ακατέργαστου εκχυλίσματος του CSL επετεύχθη χωρίς διεγχειρητικές ή/και άμεσες ή όψιμες μετεγχειρητικές επιπλοκές. Συμπεραίνουμε ότι το ακατέργαστο εκχύλισμα του CSL μειώνει την κυτταρική βιωσιμότητα της καρκινικής κυτταρικής σειράς C6. Η συγχορήγηση του με τον αλκυλιωτικό παράγοντα τεμοζολομίδη βελτιώνει το αντικαρκινικό αποτέλεσμα, απαιτώντας μικρότερες δόσεις συγκεντρώσεων του αλκυλιωτικού παράγοντα. Ο θάνατος των γλοιωματικών κυττάρων C6 προήλθε από ένα επιπλέον είδος μη αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου εξαρτώμενου από το μονοπάτι μεταγωγής σήματος των καλπαϊνών. Επιβεβαιώθηκε σύμφωνα με άλλες μελέτες, η ύπαρξη της ανοσογονικότητας της C6 καρκινικής κυτταρικής σειράς στο ορθοτοπικό ζωικό πρότυπο γλοιώματος αφού αναπτύχθηκε με επιτυχία σε ανοσοκατεσταλμένους μύες SCID BALB/c και όχι σε ανοσοεπαρκείς επίμυες Wistar. Η χορήγηση μεγαλομοριακών ουσιών με τη μέθοδο της CED είναι ασφαλής, δεν παρουσιάζει ιδιαίτερες τεχνικές δυσκολίες, και επιτυγχάνει σημαντικού βαθμού ομόκεντρης ενδοπαρεγχυματικής διήθησης πέριξ του καθετήρα. Προσφέρει δε, μια νέα οδό χορήγησης μεγαλομοριακών ουσιών στον εγκέφαλο παρακάμπτοντας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και περιορίζοντας τις ανεπιθύμητες ενέργειες της συστηματικής κυκλοφορίας.