Μελέτη επιγενετικών και φαρμακοεπιγενετικών βιοδεικτών στο σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ

Abstract

T2DM is characterized by inadequate pancreatic β-cell function, insulin resistance and chronic inflammation, which progressively lead to the occurrence of hyperglycemia. Pharmacotherapy of chronic illnesses such as T2DM should be effective, with minimal side effects and affordable. Thus, early detection of ongoing β-cell death would allow timely interventions when significant functionable β-cells are still present. The pancreatic β-cell epigenome plays a key role in the pathophysiology of T2DM, in particular changes in DNA methylation patterns highlighting the functional role of epigenetic changes and their potential clinical value. A suggested valuable biomaterial is ccfDNA, which is thought to reflect reliably the epigenetic events occurring in the affected tissue. The purpose of this research was to introduce minimally invasive epigenetic and pharmacoepigenetic biomarkers in T2DM. Specifically, the ultimate aim of the epigenetic study was to investigate the structure of ccfDNA in T2DM towards the development and validation of a pancreatic β-cell specific signature based on DNA methylation. In the pharmacoepigenetic study the aim was to investigate whether the development of hypoglycemia under sulphonylurea treatment is influenced by epigenetic factors, independently or in combination with genetic factors. In the epigenetic study, initially, the levels of total ccfDNA were quantified by Qubit assay. It was observed that median levels of ccfDNA did not differ between patients and healthy controls. The analysis of fragment size distribution of ccfDNA by capillary electrophoresis revealed that peaks around ~160bp were detected more frequently in T2DM patients, indicating cellular release during apoptosis possibly due to the on-going death of pancreatic β-cells. Also, the analysis of global DNA methylation load of ccfDNA was assessed for the first time, by Raman spectroscopy. In patients with T2DM, it was observed that ccfDNA samples had a higher peak corresponding to the structure of methyl groups than healthy controls, indicating that the T2DM patient ccfDNA is more methylated than healthy controls. Furthermore, the DNA methylation status of INS, IAPP, GCK, KCNJ11 and ABCC8 genes was investigated by SYBR-based qMSP assays in ccfDNA. In almost all studied genes unmethylated alleles (suggesting pancreatic β-cell origin) were statistically significantly elevated in patients with T2DM versus healthy controls, possibly due to the ongoing death of pancreatic β-cells. The analysis of the combination of all five genes using logistic regression, led to a model/classifier with very high accuracy, sensitivity and specificity as a biomarker of T2DM, which may be a useful minimally invasive tool in the clinical management of T2DM and of DM in general. In order to validate the classifier, we used an independent validation study group, in which we analyzed the DNA methylation profile of the five pancreatic β-cell genes and we applied their levels of unmethylated alleles into the developed classifier. The performance of the model/classifier have been reduced, probably due to the small number of individuals in this study group and the non-specific sample collection and storage with the optimized protocols for ccfDNA studies.In the pharmacoepigenetic study, the DNA methylation profile of the KCNJ11 and ABCC8 genes promoters was analyzed by SYBR-based qMSP assays in gDNA from peripheral blood leukocytes of T2DM patients under sulphonylureas treatment. Our results suggested that only methylation of the ABCC8 gene promoter can affect the occurrence of hypoglycemic events in T2DM patients treated with sulfonylureas regardless of the patient's KCNJ11 E23K genotype. However, the presence of DNA methylation in at least one promoter (KCNJ11 or ABCC8) was significantly associated with non-hypoglycemic patients who are carriers of the KCNJ11 EK allele, highlighting that the KCNJ11 E23K polymorphism in association with either of the two genes' DNA methylation may have protective role against sulfonylurea-induced hypoglycemia.Our results enriched our knowledge of the ccfDNA biology in T2DM, but also, they revealed new ccfDNA parameters of potential clinical value. Our study was the first to use experimental liquid biopsy data in combination with DNA methylation to develop a pancreatic β-cell signature with great clinical value. Validation in a larger number of T2DM patient samples and also in prospectively collected specimens may further highlight the clinical value of the signature in early diagnosis, screening and monitoring of this important disease. Also, this study was the first to evaluate the impact of DNA methylation on drug target gene promoters associated with sulphonylurea-induced hypoglycemia during T2DM treatment. The results of this study contribute further to the pharmacoepigenetic knowledge of DM pharmacotherapy and pave the way for similar studies in larger populations with increased clinical value.

Ο ΣΔΤ2 χαρακτηρίζεται από ανεπαρκή λειτουργία των παγκρεατικών β-κυττάρων, αντίσταση στην ινσουλίνη και χρόνια φλεγμονή, τα οποία οδηγούν προοδευτικά στην εμφάνιση της υπεργλυκαιμίας. Η φαρμακοθεραπεία του ΣΔΤ2, ως χρόνια νόσος, πρέπει να είναι αποτελεσματική και με ελάχιστες παρενέργειες. Η έγκαιρη ανίχνευση του συνεχιζόμενου β-κυτταρικού θανάτου θα επέτρεπε έγκαιρες θεραπευτικές παρεμβάσεις πριν από την εμφάνιση υπεργλυκαιμίας και των επιπλοκών της, όταν ακόμα θα υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός β-κυττάρων. Γνωρίζουμε ότι το επιγονιδίωμα του β-κυττάρου παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθοφυσιολογία του ΣΔΤ2, ιδιαίτερα οι αλλαγές στα πρότυπα της DNA μεθυλίωσης. Τα τελευταία χρόνια δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στην ανάπτυξη ελάχιστα επεμβατικών βιοδεικτών υγρής βιοψίας. Το ccfDNA προτείνεται ότι αντανακλά αξιόπιστα τα επιγενετικά γεγονότα που λαμβάνουν χώρα στον πάσχοντα ιστό. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάδειξη ελάχιστα επεμβατικών επιγενετικών και φαρμακοεπιγενετικών βιοδεικτών στον ΣΔΤ2. Συγκεκριμένα, στόχος της επιγενετικής μελέτης ήταν η μελέτη της δομής του ccfDNA με στόχο την ανάπτυξη και την επικύρωση ενός παγκρεατικού β-κυτταροειδικού μοντέλου/προτύπου ταξινόμησης (ταξινομητή) βασισμένου στην DNA μεθυλίωση του ccfDNA ως βιοδείκτη του ΣΔΤ2. Στην φαρμακοεπιγενετική μελέτη στόχος ήταν να διερευνηθεί αν η ανάπτυξη υπογλυκαιμίας κατά την αγωγή με σουλφονυλουρίες επηρεάζεται από επιγενετικούς παράγοντες ανεξάρτητα ή σε συνδυασμό με γενετικούς.Στην επιγενετική μελέτη, αρχικά, ποσοτικοποιήθηκαν τα επίπεδα του συνολικού ccfDNA με φασματομετρία φθορισμού (δοκιμασία Qubit) και παρατηρήθηκε ότι τα διάμεσα επίπεδα αυτού δεν διέφεραν μεταξύ των ασθενών και των υγιών μαρτύρων αλλά και των ατόμων με προδιαβήτη. Ακολούθησε η ανάλυση του μεγέθους των θραυσμάτων του ccfDNA με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε επιλεγμένα δείγματα, προκειμένου να αποκαλυφθούν για πρώτη φορά πληροφορίες σχετικά με την κυτταρική διαδικασία απελευθέρωσης του ccfDNA από τον/τους ιστό/ούς προέλευσης του στον ΣΔ. Στην ομάδα των ασθενών με ΣΔΤ2 εντοπίστηκαν συχνότερα κορυφές μεγέθους ~160bp σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει κυτταρική απελευθέρωση του ccfDNA κατά τη διάρκεια της απόπτωσης πιθανόν λόγω του συνεχιζόμενου θανάτου των παγκρεατικών β-κυττάρων (η παρατήρηση αυτή ήταν ποιοτική). Επίσης, αναλύθηκε για πρώτη φορά με φασματοσκοπία Raman το ccfDNA μικρού αριθμού επιλεγμένων δειγμάτων προκειμένου να εκτιμηθεί το ολικό φορτίο της DNA μεθυλίωσης όπως και γενικά μοτίβα χημικών δεσμών. Στα δείγματα ccfDNA των ασθενών παρατηρήθηκε να είναι υψηλότερη η κορυφή του φάσματος που αντιστοιχεί στη δομή των μεθυλομάδων σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ccfDNA των ασθενών είναι περισσότερο μεθυλιωμένο. Επιπλέον, αναλύθηκε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης πέντε παγκρεατικών β-κυτταροειδικών γονιδίων (INS, IAPP, GCK, KCNJ11 και ABCC8) στο ccfDNA με ποσοτική qMSP με χρήση της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green I. Στην ομάδα ανάπτυξης, για σχεδόν όλα τα υπό μελέτη γονίδια, τα μη μεθυλιωμένα αλληλόμορφα (που υποδηλώνουν προέλευση από τα παγκρεατικά β κύτταρα) ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στους ασθενείς με ΣΔΤ2 έναντι των υγιών μαρτύρων, πιθανώς λόγω του συνεχιζόμενου θανάτου των παγκρεατικών β-κυττάρων. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων και των πέντε γονιδίων με χρήση της λογιστικής παλινδρόμησης, οδήγησε σε έναν ταξινομητή με πολύ υψηλή ακρίβεια, ευαισθησία και ειδικότητα ως βιοδείκτη του ΣΔΤ2, που μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο ελάχιστα επεμβατικό εργαλείο στην κλινική διαχείριση του ΣΔΤ2 αλλά και του ΣΔ γενικότερα. Προκειμένου να επικυρωθεί ο ταξινομητής, χρησιμοποιήθηκε μία δεύτερη ανεξάρτητη ομάδα μελέτης (η οποία περιλάμβανε άτομα με προδιαβήτη), στην οποία αναλύθηκε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης για τα πέντε β-κυτταροειδικά γονίδια και τα αποτελέσματα εισήχθησαν στον ανεπτυγμένο ταξινομητή. Παρατηρήθηκε ότι η απόδοση του ταξινομητή μειώθηκε αρκετά, πιθανώς εξαιτίας του μικρού αριθμού ατόμων αυτής της ομάδας μελέτης και της μη ειδικής συλλογής και αποθήκευσης δειγμάτων με τα βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα.Στην φαρμακοεπιγενετική μελέτη αναλύθηκε το προφίλ της DNA μεθυλίωσης των γονιδίων KCNJ11 και ABCC8 σε gDNA λευκοκυττάρων περιφερικού αίματος απομονωμένο από ασθενείς με ΣΔT2 που λάμβαναν σουλφονυλουρίες ως θεραπευτική αγωγή. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι μόνο η μεθυλίωση του γονιδίου ABCC8 μπορεί να επηρεάσει την εμφάνιση υπογλυκαιμικών ανεξαρτήτως του γονότυπου KCNJ11 Ε23Κ του ασθενούς. Ωστόσο, η παρουσία μεθυλίωσης σε τουλάχιστον έναν υποκινητή (KCNJ11 ή ABCC8) συσχετίστηκε σημαντικά με τους μη υπογλυκαιμικούς ασθενείς οι οποίοι είναι φορείς του αλληλομόρφου KCNJ11 EK.Η μελέτη αυτή ήταν η πρώτη που παρήγαγε πειραματικά δεδομένα υγρής βιοψίας σε συνδυασμό με τη DNA μεθυλίωση, τα οποία αφενός εμπλούτισαν τη γνώση μας για τη βιολογία του ccfDNA στον ΣΔΤ2, αφετέρου ανέδειξαν νέες παραμέτρους με πιθανή κλινική αξία. Συγκεκριμένα, ήταν η πρώτη μελέτη που διερεύνησε και χρησιμοποίησε τη διαφορική μεθυλίωση β-κυτταροειδικών γονιδίων στο ccfDNA για την ανάπτυξη μιας παγκρεατικής β-κυτταρικής υπογραφής με μεγάλη κλινική αξία στον ΣΔ. Η επικύρωση σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ασθενών με ΣΔ, καθώς και σε προοπτικά συλλεγμένα δείγματα δύναται να αναδείξουν περαιτέρω την κλινική αξία της υπογραφής στην έγκαιρη διάγνωση, ανίχνευση και παρακολούθηση αυτής της σημαντικής νοσολογικής οντότητας. Ακόμη, η μελέτη αυτή ήταν η πρώτη που αξιολόγησε την επίδραση της μεθυλίωσης στους υποκινητές γονιδίων-στόχων σχετικών με την θεραπεία του ΣΔΤ2. Επιπλέον, τα ευρήματα μας ανοίγουν τον δρόμο για ανάλογες μελέτες σε μεγαλύτερους πληθυσμούς ασθενών με αυξημένη κλινική βαρύτητα.