Ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής στον κυτταρικό κύκλο των βλαστικών και καρκινικών κύτταρων

Abstract

In order to maintain genomic integrity the cells have mechanisms ensuring that DNA is replicated faithfully and only once in each cell cycle. Genomic instability can result from aberrant replication and leads to tumorigenesis. Therefore, DNA replication is under strict regulation. Licensing DNA for replication is a regulatory mechanism ensuring faithful and only once per cell cycle duplication of the genome. The pre-Replicative Complex - pre-RC- is formed after passage through mitosis, onto ORC-bound origins of replication with the sequential recruitment of the licensing factors Cdt1, Cdc6 and the Mini Chromosome Maintenance 2-7 - MCM2-7 helicase complex. Once the MCM2-7 complex is loaded, DNA is licensed for replication in the subsequent S phase. In order to avoid re-replication, the protein levels of the licensing factors Cdt1 and Cdc6 are strictly regulated throughout the cell cycle.In our previous work we were able to monitor the behavior of MCM proteins in live human cells, with the use of a real-time in vivo licensing assay and demonstrated that only a small proportion of MCM complexes are loaded upon mitotic exit, while the majority of MCM loading onto chromatin occurs in late G1, just prior to S phase onset (Symeonidou IE et al, 2013). To further characterize the loading of MCM proteins onto chromatin during G1 phase, we analyzed the association of GFP-MCM4 with chromatin, using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis, in MCF7 breast cancer cells. We observed that loading of GFP-MCM4 onto chromatin occurs in two distinct waves, upon mitotic exit, in early G1 where a small fraction interacts with chromatin and in late G1, prior to S phase entry where full loading takes place. Analysis of the licensing factors showed that Cdc6 expression closely mirrors the waves of loading of MCM complexes. Subsequently, we used Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP) to assess the timing of MCM loading onto chromatin after depleting or ectopically expressing Cdc6 at specific cell cycle phases. Depletion of Cdc6 in late G1 showed that Cdc6 re-accumulation is essential for the wave of MCM loading at the G1/S phase transition. On the other hand, ectopic expression of Cdc6 in early G1, when it is normally absent, is sufficient to drive full MCM loading earlier in the cycle. These data suggest that Cdc6 levels direct the timing and extent of MCM loading during G1. Since accurate DNA replication licensing is critical for the cells, we were interested in examining whether ablation of this additional loading step in late G1 would affect DNA replication in the subsequent S phase as well as overall progression into the cell cycle. We showed that under these conditions the cells undergo normal replication and progression into the cell cycle, however, when the cells were subjected to replication stress, they accumulated in S phase with increased DNA damage. DNA fiber analysis also revealed that under replication stress conditions the cells were unable to fire the full complement of dormant origins. These data suggest that the additional MCM loading wave in late G1 protects the cells from replication stress, by licensing dormant origins. We were also interested in investigating whether full MCM loading in late G1 would be linked with timing of early origins firing, however we weren’t able to identify such a correlation, although this hypothesis needs further investigation.To better understand the properties of an overall rapid cell cycle with a very short G1 phase, we analyzed the cell cycle and the DNA replication licensing process in mouse embryonic stem cells, which posses such characteristics. We observed that Cdt1 is expressed upon mitotic exit and in G1 phase of mESCs and MCM2 associates with chromatin from G1 phase and upon entry into S phase exhibits the characteristic early-middle-late S phase expression patterns, suggesting that the licensing process in mESCs resembles somatic cells. Maintenance of genome stability is of great importance in mESCs, since they can potentially give rise to a whole organism. Genetic lesions caused by exogenous or endogenous DNA damage can be proven disruptive for tissue and organismal homeostasis. We therefore also examined mESCs response following UV-C irradiation, at different phases of their cell cycle. We showed that mESCs are capable of arresting their cell cycle at G1/S, even though they are reported to lack restriction point. Additionally, they are able to rapidly proteolyse Cdt1, post damage in G1 phase, a feature that somatic cells also possess, while MCM2 chromatin loading exhibited an irregular phenotype, possibly due to arrest of the cell cycle. Irradiation of mESCs in mitosis revealed stabilization in Cdt1 expression, which occurred through its phosphorylation by MAP kinases, a pathway observed also in somatic cells, suggesting that similar regulatory pathways exist in pluripotent cells to maintain genomic integrity.

Προκειμένου να διατηρηθεί η γονιδιωματική ακεραιότητα, τα κύτταρα διαθέτουν μηχανισμούς που εξασφαλίζουν ότι το DNA τους αντιγράφεται πιστά και μόνο μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο. Η γονιδιωματική αστάθεια μπορεί να προκύψει από ανεξέλεκγκτη αντιγραφή και οδηγεί σε ογκογένεση. Επομένως, η αντιγραφή του DNA υπόκειται σε αυστηρή ρύθμιση. Η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA αποτελεί έναν ρυθμιστικό μηχανισμό που εξασφαλίζει την πιστή αντιγραφή του γονιδιώματος, μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο - pre-RC σχηματίζεται μετά από την έξοδο από τη μίτωση και κατά τη διάρκεια της G1 φάσης, σε αφετηρίες της αντιγραφής στις οποίες έχει προσδεθεί το σύμπλοκο ORC και με την προσέλκυση των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1, Cdc6 στρατολογούνται τα σύμπλοκα ελικασών της αντιγραφής MCM2-7. Μόλις προσδεθεί το σύμπλοκο MCM2-7 στη χρωματίνη, το DNA αδειοδοτείται για αντιγραφή στην επόμενη S φάση. Προκειμένου να αποφευχθεί η επανα-αντιγραφή του γονιδιώματος, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των αδειοδοτικών παραγόντων Cdt1 και Cdc6 ρυθμίζονται αυστηρά καθόλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου.Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας είχε μελετηθεί η συμπεριφορά των MCM πρωτεϊνών, σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα, με τη χρήση ενός συστήματος αδειοδότησης και είχε δειχθεί ότι μετά την έξοδο από τη μίτωση μόνο ένα μικρό μέρος των MCM πρωτεϊνών αλληλεπιδρά με τη χρωματίνη, ενώ η πλειοψηφία τους προσδένεται κατά το τέλος της G1 φάσης (Symeonidou IE et al, 2013). Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η συμπεριφορά της κινητικής των MCM πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της G1 φάσης, αναλυθηκε η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης GFP-MCM4 με τη χρωματίνη, με τη μέθοδο λειτουργικής μικροσκοπίας FRAP, σε ζωντανά κύτταρα MCF7 καρκίνου του μαστού. Παρατηρήθηκε ότι η πρόσδεση της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη πραγματοποείται σε δύο διακριτά στάδια. Αρχικά με την έξοδο από τη μίτωση, στην αρχή της G1 φάσης, όπου ένα μικρό μέρος της πρωτεϊνης έχει προσδεθεί, καθώς επίσης και κατά το τέλος της G1 φάσης, λίγο πρίν την είσοδο στην S φάση, όπου παρατηρείται το μεγλύτερο δεσμευμένο κλάσμα της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη. Η ανάλυση της έκφρασης των αδειοδοτικών παραγόντων κατέδειξε ότι το χρονικό πρότυπο έκφρασης του Cdc6 ομοιάζει με τα στάδια πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη. Προκειμένου να διερευνηθεί η συμμετοχή του Cdc6 στη ρύθμιση των κυμάτων δέσμευση των MCM πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι λειτουργικής μικροσκοπίας FRAP και FLIP και αξιολογήθηκε η πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη, έπειτα από την αποσιώπηση ή την εκτοπική έκφραση του Cdc6 σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Η αποσιώπηση του Cdc6 κατά το τέλος της G1 φάσης έδειξε ότι η επανασυσσώρευση του Cdc6 κατά τη G1 / S μετάβαση είναι απαραίτητη για το επιπλεόν βήμα πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών πρίν από την είσοδο σε S φάση. Από την άλλη πλευρά, όταν το Cdc6 εκφράστηκε εκτοπικά νωρίς κατά τη G1 φάση, σε χρονικό σημείο που συνήθως απουσιάζει, ήταν επαρκές για να οδηγήσει την πλήρη πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών νωρίτερα στον κυτταρικό κύκλο. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα Cdc6 κατευθύνουν το χρόνο και την έκταση της πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη κατά τη διάρκεια της G1 φάσης.Η αξιπιστία της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA είναι πολύ σημαντική για τη κύτταρο και επομένως θελήσαμε να εξετάσουμε εάν η απαλοιφή του επιπλέον βήματος πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών κατα τη G1 / S μετάβαση θα επηρεάζε τόσο την αντιγραφή του DNA στην επακόλουθη S φάση, όσο και την καθολική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Παρατηρήθηκε ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες τα κύτταρα ήταν ικανά να αντιγράφουν το γενετικό υλικό καθώς και να προχωρήσουν στον κυτταρικό κύκλο. Παρ΄όλα αυτά, όταν τα κύτταρα υπεβλήθησαν σε αντιγραφικό στρες, συσσωρεύτηκαν στην S φάση με αυξημένα δείγματα βλάβης στο DNA. Περαιτέρω ανάλυση των ινών του DNA αποκάλυψε ότι κάτω από τις συνθήκες αντιγραφικού στρες, τα κύτταρα δεν μπορούν να ενεργοποιήσουν τις ‘αδρανείς’ αφετηρίες της αντιγραφής. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι το επιπλέον βήμα πρόσδεσης των MCM πρωτεϊνών κατα το τέλος της G1 φάσης λειτουργεί ως προστατευτικός μηχανισμός των κυττάρων στο αντιγραφικό στρες, με το να αδειοδοτεί τις ‘αδρανείς’ αφετηρίες της αντιγραφής. Μελετήθηκε επίσης, εάν η πλήρης πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών στο τέλος της G1 φάσης μπορεί να συνδέεται με το χρονικό πρόγραμμα της αντιγραφής και συγκεκριμένα με την ενεργοποίηση των αφετηριών που θα αντιγραφούν νωρίς κατά την S φάση, ωστόσο δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός μια τέτοιας συσχέτισης, αν και η υπόθεση αυτή χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Προκειμένου να κατανοηθούν καλύτερα οι ιδιότητες ενός ταχέως κυτταρικού κύκλου με πολύ σύντομη φάση G1, αναλύθηκε ο κυτταρικός κύκλος και η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ποντικού (mouse embryonic stem cells - mESCs), τα οποία διαθέτουν αυτά τα χαρακτηριστικά. Παρατηρήθηκε ότι ο παράγοντας Cdt1 εκφράζεται μετά την έξοδο από τη μίτωση και στην φάση G1 των mESCs και η MCM2 υπομονάδα αλληλεπιδρά με τη χρωματίνη από τη φάση G1 και κατά την είσοδο στη φάση S παρουσιάζει τα χαρακτηριστικά πρότυπα έκφρασης αρχής – μέσης – τέλους S φάσης, υποδηλώνοντας ότι η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA των mESCs εμφανίζει ομοιότητες με αυτή των σωματικών κυττάρων.Η διατήρηση της γονιδιακής σταθερότητας είναι πολύ σημαντική στα mESCs, αφού από αυτά μπορεί να προκύψει ένας ολόκληρος οργανισμός. Οι γενετικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από εξωγενή ή ενδογενή βλάβη του DNA μπορούν να αποδειχθούν καταστροφικές για την ομοιοστασία των ιστών και των οργανισμών. Συνεπώς, εξετάστηκε η απόκριση των mESCs μετά από βλάβη στο DNA που προκλήθηκε με τη χρήση ακτινοβολίας UV-C, σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού τους κύκλου. Παρατηρήθηκε ότι τα mESCs είναι ικανά να αναστείλλουν τον κυτταρικό κύκλο τους στη G1 / S μετάβαση, ακόμη και αν έχει αναφερθεί ότι δεν εμφανίζουν σημείο ελέγχου. Επιπρόσθετα, είναι σε θέση να προτεολύσουν ταχέως το Cdt1, μετά τη βλάβη στη G1 φάση, ένα χαρακτηριστικό που διαθέτουν και τα σωματικά κύτταρα, ενώ η φόρτωση της χρωματίνης MCM2 παρουσιάζει έναν ακανόνιστο φαινότυπο, πιθανώς λόγω αναστολής του κυτταρικού κύκλου. Η ακτινοβόληση των mESCs στη μίτωση αποκάλυψε σταθεροποίηση στην έκφραση του Cdt1, η οποία πραγματοποιείται μέσω της φωσφορυλίωσης της από ΜΑΡ κινάσες, ένας μηχανισμός που παρατηρείται και σε σωματικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι παρόμοια ρυθμιστικά μονοπάτια υπάρχουν στα πολυδύναμα κύτταρα για τη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας.