Μοριακή μελέτη της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας

Abstract

Acute promyelocytic leukemia (APL) is one of acute myeloid leukemia (AML) subtypes. Since the late 1970s it has been appreciated that APL is correlated with the reciprocal translocation, t(15;17)(q22;q21), present in the majority of cases. The translocation disrupts the PML gene on chromosome 15 and the retinoic acid receptor-α (RARA) gene on chromosome 17. A variety of PML-RARA transcripts [bcr1 or Long (L), bcr3 or Short (S), bcr2 or Variable (V)] are produced due to different PML gene breakpoints and alternative splicing in chromosome 15. The FLT3 gene aberrations, including internal tandem duplications (ITDs) and D835 (tyrosine kinase domain, TKD) mutations occur in 30%-50% in APL. In APLs driven by the t(15,17) translocations, PML-RARA is most often the only driving genetic alteration; epigenetic changes seem limited. According to de The and his coauthors APL represents a monogenic cancer primarily, if not exclusively, driven by PML-RARA. The PML-RARA fusion gene can be detected by reverse transcription– polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification, a very sensitive method with the ability to identify the different fusion transcripts. 548 BM and/or PB samples from 47 patients, suffering from APL, at presentation, after every cycle of chemotherapy and every 3 to 6 months till 5 years post diagnosis were studied.The molecular study included the detection and quantification of the PML-RARA hybrid gene and the detection of FLT3 gene mutations (TKD and ITD). In the beginning of this study and in order to select the best assay for MRD detection, a comparison of qualitative RT-nested PCR, already established in the laboratory, to the quantitative Real-time PCR for the detection of PML-RARA was performed. The result of the comparison led to the replacement of the conventional "nested" RT-PCR by RQ-PCR, because of the increased sensitivity and the ability of having immediate assessment of sample suitability. In order to find a way to shorten the time needed for the assessment of a sample at diagnosis, and after the observation that each of the hybrid gene transcript was detected with different sensitivity using the three different RQ-PCR assays standardized within the EAC program, a comparison of the conventional PCR and the three protocols of RQ-PCR was performed. The conclusions from this comparison led to the selection and the establishment of RQ-PCR as the most suitable method for rapid APL diagnosis. Two PCR assays followed by fragment analysis in a sequencer were established for the detection of FLT3 gene mutations (TKD and ITD). As refered in the literature, high prognostic value for predicting relapse has the detection of PML-RARA at the end of consolidation therapy, while MRD detection at the end of induction therapy has no value. Most studies have failed to confirm the prognostic significance of FLT3 gene mutations.As part of the efforts to define potential prognostic factors that may allow early distinction of patients at high risk to relapse, transcript levels at diagnosis were correlated to the patients’ outcome, without apparent significant correlation at least until now. It should be noted that no conclusions could be drawn due to the limited number of patients in this study. Nevertheless the application of quantitative PCR allowed the rapid and accurate diagnosis of APL, as well as the safe monitoring of MRD with great sensitivity. As the results of this study have shown, the close molecular monitoring of APL MRD using RQ-PCR can help predicting and subsequently preventing hematologic relapse by early intervention.

Η ΟΠΛ είναι ένας ξεχωριστός υπότυπος της Οξείας Μυελογενούς Λευχαιμίας, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία της αντιμετάθεσης t(15;17)(q22;q21), η οποία περιγράφτηκε για πρώτη φορά το 1977 και από την ανταπόκριση στη θεραπεία με all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA). Σε αυτή την αντιμετάθεση το γονίδιο PML από το χρωμόσωμα 15q ενώνεται με το γονίδιο RARΑ στο χρωμόσωμα 17q με αποτέλεσμα την παραγωγή δύο μεταγραφικά ενεργών υβριδικών γονιδίων των PML-RARA και RARΑ-PML. H αμοιβαία χρωμοσωμική μετάθεση t(15;17) ανιχνεύεται σε ποσοστό 92% ενώ το γονίδιο PML-RARA σε ένα επιπλέον ποσοστό 6% των περιστατικών. Σύμφωνα με τους de The και συνεργάτες, η ΟΠΛ αποτελεί μία μονογονιδιακή κακοήθεια, η οποία κυρίως και πιθανά αποκλειστικά οφείλεται στην πρωτεΐνη PML-RARA.Η RT-PCR αποτελεί τη μέθοδο εκλογής για την επιβεβαίωση της διάγνωσης ΟΠΛ. Εκτός από τη μεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία έχει τη δυνατότητα ταυτοποίησης του μεταγράφου του υβριδικού γονιδίου, που είναι απαραίτητο για την παρακολούθηση της ΕΥΝ.Μελετήθηκαν 548 δείγματα, από 47 ασθενείς με ΟΠΛ, τα οποία συλλέχτηκαν κατά τη διάγνωση, μετά από κάθε κύκλο χημειοθεραπείας και ακολούθως ανά 3-6 μήνες μέχρι τα πέντε χρόνια μετά τη διάγνωση. Η μοριακή μελέτη αφορά στην ανίχνευση και ποσοτική εκτίμηση του υβριδικού γονιδίου PML-RARA, καθώς και των μεταλλάξεων (TKD και ITD) του γονιδίου FLT3. Έγινε προσπάθεια αξιολόγησης των τεχνικών, που χρησιμοποιούνταν στο εργαστήριο σε σχέση με νέες τεχνικές ποσοτικής εκτίμησης του υβριδικού γονιδίου, με RQ-PCR, για την παρακολούθηση της ΕΥΝ. Το αποτέλεσμα της σύγκρισης οδήγησε στην κατάργηση της συμβατικής “nested” RT-PCR και την αντικατάστασή της από την RQ-PCR, λόγω της μεγαλύτερης ευαισθησίας της αλλά και της δυνατότητας για άμεση αξιολόγηση της καταλληλότητας του δείγματος. Η προσπάθεια εύρεσης τρόπου συντόμευσης του χρόνου από τη στιγμή της παραλαβής του δείγματος μιας πιθανής ΟΠΛ μέχρι την έκδοση του αποτελέσματος αφενός και η παρατήρηση ότι κάθε μετάγραφο του υβριδικού γονιδίου ανιχνευόταν με διαφορετική ευαισθησία από τις τρεις διαφορετικές δοκιμασίες RQ-PCR, που είχαν τυποποιηθεί στα πλαίσια του προγράμματος EAC αφετέρου, οδήγησαν στη σύγκριση της συμβατικής PCR και των τριών πρωτοκόλλων της RQ-PCR για την ανίχνευση και σωστή ταυτοποίηση του μεταγράφου του υβριδικού γονιδίου κατά τη διάγνωση. Τα συμπεράσματα από τη σύγκριση αυτή οδήγησαν στην επιλογή της RQ-PCR για τη γρήγορη διάγνωση της ΟΠΛ. Για την ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου FLT3 (TKD και ITD) εφαρμόσθηκαν δύο δοκιμασίες PCR, βασιζόμενες σε fragment analysis σε αυτόματο αναλυτή αλληλουχιών.Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι είναι μεγάλης σημασίας η ανίχνευση του PML-RARA μεταγράφου στο τέλος της θεραπείας σταθεροποίησης ως δείκτη ισχυρής προγνωστικής αξίας για την πρόβλεψη της υποτροπής, ενώ δεν έχει προγνωστική αξία η ανίχνευσή του στο τέλος της θεραπείας εφόδου. Οι περισσότερες μελέτες ωστόσο δεν κατάφεραν να επιβεβαιώσουν την προγνωστική σημασία ανίχνευσης των μεταλλάξεων του γονιδίου FLT3.Στα πλαίσια της προσπάθειας καθορισμού προγνωστικών παραγόντων, που θα επιτρέπουν να διακρίνονται έγκαιρα οι ασθενείς υψηλού κινδύνου για υποτροπή, έγινε αξιολόγηση των τιμών των μεταγράφων κατά τη διάγνωση σε σχέση με την περαιτέρω πορεία και την έκβαση των ασθενών, χωρίς όμως να προκύπτει, τουλάχιστον μέχρι τώρα, σαφής συσχέτιση.Πρέπει να σημειωθεί ότι ο αριθμός των ασθενών της παρούσας μελέτης, είναι μικρός ώστε να μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα.Γεγονός πάντως είναι ότι, η εφαρμογή της ποσοτικής PCR έδωσε στο εργαστήριο τη δυνατότητα γρήγορης και ακριβούς διάγνωσης της ΟΠΛ, όπως και τη δυνατότητα ασφαλούς παρακολούθησης της ΕΥΝ με μεγάλη ευαισθησία. Η στενή μοριακή παρακολούθηση με τη χρήση της RQ-PCR μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη και κυρίως στην πρόληψη, με την έγκαιρη θεραπευτική αντιμετώπιση, αιματολογικών υποτροπών της ΟΠΛ, όπως ήδη φαίνεται, από τα αποτελέσματα της εργασίας.