Πρωτεϊνική μηχανική και μοριακή μελέτη του ενζύμου τρανσφεράση της γλουταθειόνης

Abstract

GSTs constitute an important enzyme superfamily and are found in almost all the organisms (prokaryotic and eukaryotic) as isoenzymes of different selectivity. They are multifunctional enzymes, that are involved in the cell detoxification mechanism by inactivating endogenous or exogenous toxic compounds, creating a covalent bond with glutathione (GSH). The conjugation reactions result in producing less toxic and more water soluble derivatives, that can be easily eliminated from the organism. However, their roles are not limited in detoxification, as they also contribute to other functions, such as the transport and storage of various hydrophobic molecules. In addition, they play a crucial role in the protection of cells from a wide range of stress conditions, such as heavy metals, UV radiation, as well as biotic and abiotic stress. The considerable interest of these enzymes is justified, due to their applications in various fields, such as biotechnology, medicine, agriculture, etc.In the first part of the dissertation, ancestral GSTs were designed and studied. In particular, phylogenetic analysis of GST sequences from Glycine max, Agrobacterium tumefaciens, as well as GSTs of various organisms was performed, in order to predict ancestral sequences using FastML program. Following phylogenetic analysis, four ancestral enzymes were designed (N1 Ancient, N10 AtuGST, N20 Ancient and N1 Tau). The enzymes were characterized using steady-state kinetics analysis. The kinetic parameters (Km, kcat) towards 1-bromo-2,4-dinitrobenzene (BDNB) and GSH were determined. In addition, their substrate specificity towards nineteen potential substrates was investigated and finally, their structural stability was studied. The results showed that the ancestral enzymes display restricted substrate specificity. Thermostability analysis suggested that they display moderate thermostability. Along with this study, a GST isoenzyme from Thermosynechococcus elongatus, a thermophilic monocyte cyanobacteria, was also cloned, expressed in E. coli and purified. The results showed that TeGST exhibits comparable kinetic and structural properties to that of the ancient enzymes. In the next part of the thesis, the catalytic diversity of GST isoenzymes from different plants was investigated. In particular, the isoenzyme GmGSTU8-8 from Glycine max, the isoenzyme PvGSTU2-2 from Phaseolus vulgaris, as well as, two mutants (PvGSTU2-2.1 and PvGSTU2-2.10). Steady-state kinetic analysis was performed to determine the kinetic parameters (Km, kcat) towards a range of different electrophile substrates. The binding and the structural features of these enzymes were also investigated. Kinetic inhibition analysis showed that teflubenzuron displayed mixed type inhibition. Furthermore, the mutant PvGSTU2-2.1 was subjected to structural determination by X-ray crystallography and the results showed that the enzyme forms octamers. In the next part of the thesis, we aim at studying the catalytic, structural and binding features of GSTs from Camelus dromedaries, from different GST classes, CdGSTP1-1 and CdGSTM1-1. The results showed that both isoenzymes appeared to obey the Michaelis-Menten kinetics, with the mu class GST displaying higher affinity towards both substrates. Both enzymes display wide substrate specificity and did not appear to be particular thermostable. The study of the ligandin function of CdGSTP1-1 and CdGSTM1-1 indicated that both enzymes exhibit a rather reduced ability to bind xenobiotic compounds in a non-substrate manner. However, CdGSTM1-1 appears to be very sensitive towards the fungicide Zoxium zoxamide (IC50 1.49 ± 0.068 μΜ). Kinetics inhibition analysis showed that, using CDNB as a variable substrate, Zoxium zoxamide displayed purely competitive inhibition, whereas when using GSH as a variable substrate, Zoxium zoxamide showed mixed-type inhibition. The structure of CdGSTM1-1 was determined by X-ray crystallography. The results showed that the enzyme displays the characteristic GST fold. Following the study of the catalytic diversity of GSTs, from various classes and organisms, the isoenzyme PvGSTU2-2.1 was selected for the development of an enzyme biosensor capable to detect teflubenzuron in water samples. The enzyme PvGSTU2-2.1 was tethered by cross-linking with glutaraldehyde in the presence of BSA. Following the successful immobilization of the enzyme, the kinetic characteristics of the immobilized enzyme, as well as its ability to detect teflubenzuron in water samples and the lifetime of the biosensor were evaluated. The results showed that the immobilized enzyme display high affinity towards teflubenzuron (IC50 26.4 ± 2.5 nM). The biosensor was capable to detect teflubenzuron in both drinking water and mineral water samples within the linear concentration range 3-75 nM.

Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) αποτελούν μια σημαντική υπερ-οικογένεια ενζύμων και υπάρχουν σχεδόν σε όλους τους οργανισμούς (προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς) ως ισοένζυμα διαφορετικής εκλεκτικότητας. Πρόκειται για πολυλειτουργικά ένζυμα, τα οποία συμμετέχουν στο μηχανισμό αποτοξίνωσης του κυττάρου, αδρανοποιώντας ενδογενείς ή εξωγενείς τοξικές ενώσεις, μέσω της δημιουργίας ομοιοπολικού δεσμού με την γλουταθειόνη. Τα σύμπλοκα που δημιουργούνται είναι λιγότερο τοξικά και πιο υδατοδιαλυτά, με αποτελέσμα να απεκρίνονται πιο εύκολα από τον οργανισμό. Ωστόσο, οι ρόλοι τους δε περιορίζονται μόνο στην αποτοξίνωση, αφού συμβάλλουν και σε άλλες λειτουργίες, όπως η μεταφορά και αποθήκευση διάφορων υδρόφοβων μορίων. Επιπλέον, παίζουν σημαντικό ρόλο σε διαφόρων ειδών καταπονήσεις, όπως καταπόνηση από βαρέα μέταλλα, ακτινοβολία, καθώς επίσης βιοτικό και αβιοτικό στρες, κ.α. Τα συγκεκριμένα ένζυμα βρίσκονται στο επίκεντρο της έρευνας, καθώς βρίσκουν πολλές εφαρμογές σε διάφορους τομείς, όπως η βιοτεχνολογία, η ιατρική, η γεωπονία κ.α. Στο πρώτο μέρος της διατριβής, σχεδιάστηκαν και μελετήθηκαν αρχέγονες μορφές του ενζύμου. Πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση GST αλληλουχιών από Glycine max, Agrobacterium tumefaciens καθώς και GSTs διάφορων οργανισμών, με σκοπό να γίνει in silico σχεδιασμός αρχέγονων αλληλουχιών με τη χρήση του προγράμματος FastML. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του in silico σχεδιασμού, σχεδιάστηκαν τέσσερα αρχέγονα ένζυμα (N1 Ancient, N10 AtuGST, N20 Ancient & N1 Tau), προκειμένου να μελετηθούν τα κινητικά και δομικά τους χαρακτηριστικά. Επίσης, μελετήθηκε η αλληλουχία του οργανισμού Thermosynechococcus elongates, ενός θερμόφιλου μονοκύτταρου κυανοβακτηρίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ένζυμο TeGST δεν εμφανίζει σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα υπόλοιπα αρχέγονα ένζυμα που μελετήθηκαν, όσον αφορά στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά τους.Το επόμενο κεφάλαιο της εργασίας αφορά τη μελέτη GSTs της tau τάξης από φυτικούς οργανισμούς και πιο συγκεκριμένα από φυτά σόγιας (Glycine max) και φασολιού (Phaseolus vulgaris), καθώς επίσης και μεταλλαγμένες μορφές του ενζύμου. Αρχικά, μελετήθηκε το ισοένζυμο GSTU2-2 από φασόλι καθώς επίσης και δυο μεταλλαγμένα ισοένζυμα του ίδιου οργανισμού (PvGSTU2-2.1 και PvGSTU2-2.10). Μελετήθηκε η αλληλεπίδραση τους με τριάντα οκτώ διαφορετικά φυτοφάρμακα για την εύρεση πιθανών αναστολέων, προσδιορίστηκαν οι κινητικές σταθερές (Km, kcat) για τα υποστρώματα 1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζόλιο (CDNB) και γλουταθειόνη (GSH) και, τέλος, μελετήθηκαν για τη θερμική τους σταθερότητα. Όσον αφορά στις φυτοπροστατευτικές ενώσεις, το ισοένζυμο PvGSTU2-2.1 αναστέλλεται σημαντικά από την ένωση Teflubenzuron. Έτσι, υποβλήθηκε σε περαιτέρω μελέτη, προκειμένου να προσδιοριστεί η τιμή IC50, ο τύπος αναστολής καθώς επίσης και η σταθερά αναστολής Ki. Τέλος, πραγματοποιήθηκε επίλυση και ανάλυση της κρυσταλλικής δομής της μεταλλαγμένης μορφής PvGSTU2-2.1 με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, τα αποτελέσματα της οποίας έδειξαν ότι το ένζυμο δημιουργεί οκταμερή. Στο ίδιο κεφάλαιο, μελετήθηκε το ένζυμο GSTU8-8 από Glycine max. Οι κινητικές παράμετροι έδειξαν ότι το συγκεκριμένο ένζυμο έχει πολύ υψηλή συγγένεια ως προς τα δυο υποστρώματα που μελετήθηκαν. Επίσης, μελετήθηκε η εξειδίκευση του ως προς άλλα πιθανά υποστρώματα και φάνηκε ότι πρόκειται για ένα ένζυμο με ευρεία εκλεκτικότητα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη για να εξακριβωθεί ο ρόλος του σε μη καταλυτικές λειτουργίες και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι είναι ικανό να δεσμεύει ενώσεις που δεν είναι υποστρώματα του. Τέλος, η μελέτη της θερμοσταθερότητας υπέδειξε ότι πρόκειται για ένα από τα πιο θερμοσταθερά ένζυμα της τάξης tau. Στον τελευταίο άξονα της διατριβής μελετήθηκαν δυο ένζυμα GSTs από καμήλα (Camelus dromedarius), διαφορετικών τάξεων, το CdGSTP1-1 και το CdGSTM1-1, και χαρακτηρίστηκαν τα κινητικά και δομικά τους χαρακτηριστικά, η θερμοσταθερότητά τους, καθώς και η εκλεκτικότητά τους έναντι διάφορων υποστρωμάτων και διάφορων φυτοπροστατευτικών ενώσεων. Τα δυο ένζυμα φάνηκε να υπακούουν στην εξίσωση κινητικής των Michaelis-Menten και δε φάνηκε να είναι ιδιαίτερα θερμοανθεκτικά. Η μελέτη ως προς τις μη καταλυτικές τους λειτουργίες έδειξε ότι δεν εμφάνισαν ιδιαίτερη ικανότητα δέσμευσης ξενοβιοτικών ενώσεων, που δεν λειτουργούν ως υποστρώματα. Τα δυο ένζυμα φάνηκε να εμφανίζουν ευρεία εκλεκτικότητα. Η μελέτη φυτοφαρμάκων ως πιθανών αναστολέων έδειξε ότι το CdGSTM1-1 αναστέλλεται πλήρως από το μυκητοκτόνο Zoxium zoxamide. Έτσι, μελετήθηκε περαιτέρω και προσδιορίστηκε η τιμή IC50, ο τύπος αναστολής καθώς επίσης και οι σταθερές αναστολής. Τέλος, μελετήθηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά του ενζύμου CdGSTM1-1 ύστερα από επίλυση και ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του ενζύμου με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και φάνηκε ότι το ένζυμο εμφανίζει την κλασσική δομή των GSTs. Τέλος, επιλέχθηκε το ισοένζυμο με τα πιο επιθυμητά χαρακτηριστικά, προκειμένου να κατασκευαστεί ένας ενζυμικός βιοαισθητήρας, ικανός να ανιχνεύει μια φυτοπροστατευτική ένωση από δείγματα νερού. Η μεταλλαγμένη μορφή PvGSTU2-2.1, η οποία εμφάνισε εξαιρετική θερμοσταθερότητα και υψηλή αναστολή ως προς το Teflubenzuron επιλέχθηκε να ακινητοποιηθεί. Έπειτα από την επιτυχή ακινητοποίηση, μελετήθηκαν τα κινητικά χαρακτηριστικά της ακινητοποιημένης μορφής, η τιμή IC50, η επαναληψιμότητα των μετρήσεων, η ικανότητα ανίχνευσης της ένωσης σε δείγματα νερού και ο χρόνος ζωής του βιοαισθητήρα.